犬热应激过程中HSP70和免疫相关细胞因子的变化

朱 骞，秦海斌，孙钦伟，宋珍华，张雅晨，温 海，贺星亮，张汇东*

(1.公安部南京警犬研究所警犬技术公安部重点实验室，江苏南京 210012；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095)



犬热应激过程中HSP70和免疫相关细胞因子的变化

朱 骞1，秦海斌1，孙钦伟2，宋珍华1，张雅晨2，温 海1，贺星亮1，张汇东1*

(1.公安部南京警犬研究所警犬技术公安部重点实验室，江苏南京 210012；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095)

为研究热应激造成犬免疫机能损伤的机制及损伤过程中免疫相关细胞因子的变化规律，分别在夏季持续高热天气中每隔7d、分5次采集了拉布拉多犬的血清和外周血单个核细胞(PBMC)，检测血清中皮质醇(COR)、热休克蛋白70(HSP70)、白细胞介素2((IL-2)和白细胞介素(IL-10)、Toll样受体2(TLR-2)和Toll样受体4(TLR-4)的含量及PBMC中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4的mRNA的表达，并与春季非应激温度下检测的同类指标进行比较。结果显示，夏季持续高热天气中犬长期处于应激状态，其PBMC中HSP70mRNA表达上调，IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4mRNA表达下调；血清中COR浓度持续高于正常值，HSP70浓度升高，IL-2、TLR-2浓度未发生显著变化，IL-10、TLR-4浓度显著低于正常水平。热应激条件下PBMC中白介素和Toll样受体mRNA表达下调，可能是导致犬的免疫功能抑制、抗感染免疫机能下降的原因。

犬；热应激；热应激蛋白；白细胞介素；Toll样受体；mRNA

近年来，犬作为实验动物、伴侣动物、军警战斗装备在科学研究、社会生活、社会公共安全领域中发挥的作用日益增大，但由于冷热、运输、运动、免疫等引发的应激反应，经常导致犬的免疫、内分泌机能紊乱，甚至发生应激性疾病乃至死亡[1-3]。热应激是最常见的应激反应，造成犬的生产和工作性能、抗病力的下降，但其发生机制，尤其是热应激对犬免疫机能的影响、免疫相关细胞因子的变化规律等均未见相关报道。本研究针对犬热应激期间血清和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC))中的皮质醇(cortisol，COR)、热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)、白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)和Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR-2)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)等与免疫相关的细胞因子和受体，研究它们在蛋白和mRNA水平的变化，旨在揭示热应激对犬免疫机能的影响及细胞因子的调控规律，为犬的应激理论、抗应激药物的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 试验用拉布拉多犬由公安部南京警犬研究所实验动物中心提供，共12只，12月龄～18月龄，试验全程在实验动物中心进行。

1.1.2 主要仪器与试剂 放免设备PerkinElmer Wizard 1470自动伽玛计数仪为珀金埃尔默仪器(上海)有限公司产品；Step One Plus Realtime PCR System为ABI 公司产品；皮质醇(COR)放射免疫分析药盒为北京北方生物技术研究所产品；犬HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2和TLR-4定量检测 ELISA试剂盒为上海朗顿生物科技公司产品；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus) 为宝生物工程(大连)有限公司产品；引物及探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 引物和探针 荧光定量PCR所用引物信息见表1。引物用Primer 5.0软件设计。

1.2 方法

1.2.1 试验犬分批及采样方法 分批采样方法参照文献[4]，12只试验犬在春季非热应激温度下采样1次，作为正常对照组；进入夏季高温应激期后，连续采样4次，采样间隔期为7d，分别作为第1、2、3、4批次热应激测量组(试验1组、2组、3组和4组)；同时记录采样当日气温和湿度，计算温湿指数(THI)以确定犬是否处于热应激状态[5]。在安静状态下自犬的前肢内侧静脉分别采集抗凝血、非抗凝血各2mL，抗凝血用于分离外周血单核细胞，非抗凝血用于分离血清，血清于-70℃保存，用于细胞因子ELISA定量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 血清COR浓度测定 使用放射免疫法检测5个批次血清样本中COR的浓度，由南京市第一医院临床核医学中心完成，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.3 血清中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4蛋白定量 使用ELISA试剂盒检测血清中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4的含量。操作按试剂盒说明书进行。

1.2.4 PBMC中HSP70、IL-2、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA表达量测定 Trizol法提取PBMC细胞总RNA，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒反转录成cDNA作为模板，用荧光定量PCR检测HSP70、IL-2、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA水平[6]。实时荧光定量 PCR 按照 SYBR®Premix ExTaqTMⅡ 荧光定量试剂盒进行，总体系为 20μL：cDNA 2μL，SYBR○RPremix ExTaqTM Ⅱ(2×)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各

0.5μL，ROX Reference Dye Ⅰ(150×)0.4μL，RNase-free水补齐 20μL。反应条件：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环；72℃ 20s。根据样品相应基因的Ct值，通过2-ΔΔCt法换算目的基因mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 采样当日温度、THI与血清中COR含量

采样当日的气温、THI及血清中COR的检测结果见表2，可见采样时气温均高于32℃，THI值高于80，此温度、THI下试验犬均处于热应激状态；血清中COR值也显示，与对照组比较，试验组4次COR检测值均显著高于对照组，证明试验犬处于热应激状态。

表2 采样当日气温与THI值Table 2 Amnient temperatures and THI at the sampling days

2.2 血清HSP70含量和PBMC中HSP70mRNA表达量分析

不同批次血清样品中HSP70含量检测结果见表3。可见，与对照组相比，高温条件下犬血清中HSP70浓度升高，其中第1批次样品中HSP70含量极显著升高(P<0.01)，第2批次下降，与对照组相比差异不显著，第3、4批次的又略有升高，且与对照组相比差异显著(P<0.05)。

PBMC中HSP70的mRNA表达趋势见表3。从表3可见，与对照组相比，高温条件下4批次PBMC样品中HSP70mRNA表达量第1批次显著高于对照组，后面3个批次与对照组相比差异不显著。

2.3 血清IL含量和PBMC中IL mRNA表达量变化

血清IL-2在4批次样品中呈现先下降后升高趋势，与对照组比较，第1、2批次样品中IL-2含量极显著下降(P<0.01)，第3、4批次样品中IL-2含量极显著升高(P<0.01)。IL-10在4批次样品中呈现先下降后升高趋势，与对照组比较，4批次样品中IL-10含量均显著降低(表4)。

PBMC中IL-2mRNA 表达呈先升高后下降趋势，但总体均低于对照组的；第2批次PBMC中IL-2mRNA表达量最高。PBMC 中IL-10mRNA表达量呈现逐渐下降趋势，与对照组相比，前3批次PBMC中IL-10mRNA降低不显著，但第4批次PBMC中IL-10显著降低。

表3 HSP70血清中含量及PBMC中mRNA表达量变化Table 3 Changes of HSP70contents in serum and mRNA expressions in PBMC

表4 IL-2、IL-10在血清中含量及PBMC中mRNA表达量变化Table 4 Changes of IL-2and IL-10contents in serum and mRNA expressions in PBMC

2.4 血清TLR含量和PBMC中TLR mRNA表达量变化

结果见表5。血清TLR-2在4批次样品中呈现波动式变化，第1批次血清中TLR-2浓度升高但与对照组相比差异性不显著，第2批次血清中TLR-2浓度迅速降低至低于对照组的且差异极显著(P<0.01)，第3、4批次血清中TLR-2含量又逐步恢复至正常值且与对照组相比差异不显著。血清TLR-4含量亦呈现先升高后下降趋势，4批次血清中TLR-4含量均低于对照组，第1、2批次的差异显著，第3、4批次的差异极显著(P<0.01)。

PBMC中TLR-2、TLR-4mRNA表达检测结果见表5。 4批次PBMC中TLR-2mRNA表达呈先升高后降低，与对照组相比，前3批次样品中的变化不显著，第4批次样品中TLR-2mRNA显著降低(P<0.05)。TLR-4mRNA表达量呈现持续下降趋势，与对照组相比，前3批次的降低不明显，第4批次样品中TLR-4mRNA极显著降低(P<0.01)。

表5 TLR-2、TLR-4在血清中含量及PBMC中mRNA表达量变化Table 5 Changes of TLR-2and TLR-4contents in serum and mRNA expressions in PBMC

3 讨论

在人和其他动物上进行的应激理论的研究已经证实应激能够影响免疫机能[7-10]，这种影响是经由神经-内分泌系统与免疫系统之间共有的化学信息分子(神经递质、神经肽、细胞因子等)及其受体来实现的[11-12]。细胞因子是一类具有调节免疫功能的小分子蛋白质，它作为神经-内分泌系统与免疫系统之间信息交流的重要介质，在应激过程中发挥着重要作用。目前，关于犬应激过程中激素、热应激蛋白、细胞因子如何变化、如何相互影响并最终影响免疫机能改变的具体机制仍未阐明。外周血单核细胞(PBMC)作为一类重要的免疫效应细胞[13]，不仅能够分泌多种细胞因子(HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4等)，其细胞表面也具有多种重要的免疫相关抗原和受体，PBMC中相关因子的mRNA表达情况对于研究热应激与免疫抑制具有重要意义。

本研究对血清中COR、HSP70、IL2、IL-10、TLR-2和TLR-4的浓度变化以及PBMC中同类指标的mRNA表达情况进行分析，来探讨热应激过程中免疫机能损伤和调控的机制。

HSP70广泛存在于细胞骨架和核骨架内，与核仁和细胞膜结合提高细胞对热的耐受力，高温可诱导其在组织细胞内快速高表达，以修复高温引起的蛋白质损伤，增强细胞抗御热损伤的能力。外周循环血中也存在HSP70蛋白，其来源一方面是组织细胞死亡或凋亡时释放，另一方面是应激时组织细胞主动分泌[14]，其含量变化与机体的病理、生理状态密切相关。Pockley A G等[15]检测人的循环血液中的HSP70，发现健康正常人在遭受心理和生理应激时血浆HSP70也会升高，HSP70高表达可以有效保护应激机体的心肌组织，若高温应激未能引起HSP70的高表达，则中暑发生的风险性更大[16]。研究显示，外周血中HSP70有可能参与机体的免疫调节，HSP70的刺激可导致单核细胞膜TLR-4受体数目显著下调、TNF-α浓度增加[17]。本研究检测了试验犬在中度热应激状态下血液和PBMC中的热应激蛋白HSP70的表达变化，发现无论是血清中还是PBMC中的HSP70均呈现先升高、后逐渐降低的趋势，血清中蛋白含量和细胞中mRNA的表达趋势基本一致，说明在热应激初期HSP70的高表达对于维持组织细胞、包括PBMC的基本功能是必需的；对于PBMC而言，这种高表达是不连续的，在初期经历高水平表达后会回复至正常水平，但在热应激后期失去HSP70的保护会对PBMC的正常机能产生一定影响，本试验中测量的多个细胞因子和受体的下调可能与此有关。

白细胞介素是一类重要的细胞因子，其中IL-2是一种重要的Thl型细胞因子，具有免疫增强作用，多种免疫抑制疾病均与IL-2或IL-2受体表达紊乱有关；IL-10主要发挥抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-γ及促炎因子的产生和释放。本研究中，IL-10mRNA在PBMC中的表达在热应激初期保持正常水平，在后3批次PBMC中的表达持续下调；在血清中的含量则是在热应激初期下降至最低水平然后逐步恢复，但整个过程中均低于正常水平；IL-10在PBMC和血清中表达的同时下调，说明热应激对机体整体合成IL-10的具有明显影响，并且提示热应激后期机体抗炎能力的会有一定减弱。对于PBMC中IL-2mRNA的持续下调，说明热应激影响了外周血单个核细胞中IL-2的合成；血清IL-2在后2批次血清样品中的含量逐渐升高至正常水平，这可能是中枢免疫器官的代偿性分泌，同时也可以看出热应激对IL-2的分泌影响不大。

TLRs是存在于细胞上介导炎性介质产生的重要受体，在宿主防御反应中的至关重要，是天然免疫与获得性免疫的“桥梁”，关于TLRs的相关研究已成为生命科学领域的热点[18]。本研究中，血清TLR-2在4批次样品中呈现波动变化，第2批次显著降低，第3批次又显著升高；而PBMC中mRNA表达在第4批次显著降低。血清TLR-4含量呈现先升高后下降趋势，4批次血清中TLR-4含量均低于对照组，第1、2批次的差异显著，第3、4批次的差异极显著；PBMC中TLR-4mRNA的表达亦呈现先升高后下降趋势，且4批次样品的测量值均低于正常值。这说明热应激造成了PBMC中TLR-2mRNA的表达下调，但可能由于TLR-2在脾脏和外周血白细胞中均有较高水平的表达，从而造成本研究中外周血白细胞中TLR-2的表达下调而并未造成血清中TLR-2的整体水平下降。而TLR-4在外周血白细胞的表达最为丰富，其表达情况受热应激的影响较为明显，在本研究中则体现为TLR-4在血清中和PBMC中的协同下调。

综上所述，研究发现热应激对犬的免疫机能产生了一定影响，外周血单核细胞主要细胞因子(IL-2、IL-10)、模式识别受体(TLR-2、TLR-4)表达量下调尤为明显，鉴于PBMC及其表面标志在先天免疫和获得性免疫中的重要作用，其膜表面细胞因子和相关受体的下调必然会导致机体免疫机能的减弱，笔者分析这可能是犬在经历长期热应激后免疫力低下、易受各种病原微生物侵害的的内在原因。其次，血清中的IL-2、IL-10的整体水平能够自我恢复，这有赖于机体的激素、热应激蛋白的调节和保护，但TLR-2、TLR-4含量的持续下调，也会对机体的抗感染免疫机能产生不利影响。

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Variation of HSP70and Some Related Cytokines during Heat Stress in Dogs

ZHU Qian1,QIN Hai-bin1,SUN Qin-wei2,SONG Zhen-hua1,ZHANG Ya-chen2,WEN Hai1,HE Xing-liang1,ZHANG Hui-dong1

(1.PolicedogTechnologyKeyLaboratoryofMPS,NanjingPolicedogResearchInstituteofMPS,Nanjing,Jiangsu,210012,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

To study the mechanism of the canine immune function damage under heat stress and changes of some related cytokines in this damage process，samples from twelve Labrado dogs were collected by five times at seven-day intervals in a continuous high temperature summer.Concentrations of COR,HSP70,IL-2,IL-10,TLR-2,TLR-4in sera and their mRNA expression levels in PBMC were detected by ELISA and real time RT-PCR.Each index under heat stress state was compared with the normal level under non heat stress in spring.Results of COR concentration showed that all dogs were under heat stress in the summer high temperatures.Concentrations of COR and HSP70increased in blood serum.IL-2and TLR-2unchanged,while IL-10and TLR-4levels decreased significantly.In PBMC,only the mRNA expression of HSP70was up-regulated.IL-2,IL-10,TLR-2,TLR-4mRNA were all down-regulated.These results proved that the increased expression of HSP70was neccessary for immune cells maintaining their normal structure and functions.Down-regulations of mRNA expressions of IL-2,IL-10,TLR-2and TLR-4in PBMC may be an important reason for immune suppression and anti-infection immune decline under chronic heat stress in dogs.

dog;heat stress;HSP70;interleukin;TLR;mRNA

2015-06-26

公安部重点研究计划项目(2011ZDYJNJGQ011)；公安部应用创新计划项目(2010YYCXNJJQ151)

朱 骞(1980-)，女，江苏扬州人，硕士，主要从事动物分子生物学研究。*通讯作者

S852.21

A

1007-5038(2016)01-0029-05