β⁃七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠脊髓组织水通道蛋白4与水通道蛋白9表达的影响

陈勇，赤仁杰

（沈阳医学院附属中心医院骨三科，沈阳 110024）

β⁃七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠脊髓组织水通道蛋白4与水通道蛋白9表达的影响

陈勇，赤仁杰

（沈阳医学院附属中心医院骨三科，沈阳 110024）

目的探讨β⁃七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠水通道蛋白（AQP）4与AQP9表达的影响。方法成年雌性SD大鼠150只，随机分为假手术组、脊髓损伤组和β⁃七叶皂甙钠组，每组50只。用改良的Allen’s法建立急性脊髓损伤模型后，术后行BBB运动功能评分及斜板实验评价大鼠后肢功能，免疫组化和Western blotting方法检测各组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的表达变化。结果相比于假手术组，各时间点脊髓损伤组和β⁃七叶皂甙钠组运动功能评分及斜板实验评分均显著降低（P＜0.05）；但是第7天开始，各时间点β⁃七叶皂甙钠组大鼠后肢功能恢复情况明显优于脊髓损伤组（P＜0.05）。相比于假手术组，各时间点脊髓损伤组和β⁃七叶皂甙钠组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的含量显著升高（P＜0.05）；但是与同时间点脊髓损伤组相比，β⁃七叶皂甙钠组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的含量显著降低（P＜0.05）。结论β⁃七叶皂甙钠能够通过降低AQP4与AQP9蛋白表达对脊髓损伤大鼠的神经功能发挥保护作用。

脊髓损伤；β⁃七叶皂甙钠；水通道蛋白4；水通道蛋白9；大鼠

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脊髓损伤是一种非常严重的外伤，随着交通业和建筑业的发展，其发生率逐年上升，常常导致患者终身瘫痪，而且其继发性损伤也会引起各种并发症，甚至死亡［1］。研究［2］发现，脊髓损伤后，脊髓损伤区的水通道蛋白（aquaporin，AQP）表达增加，水分子会大量地进入损伤部位，使脊髓压力迅速升高，继而引起脊髓水肿的发生，加重脊髓内微循环障碍，加重脊髓继发性损伤。目前对脊髓损伤后引起的水肿研究甚少，脊髓水肿发生的分子生物学机制尚不十分清楚，但猜测AQP与组织水肿关系密切。本研究通过Allen’s法制作脊髓损伤模型，免疫组化和Western blotting方法检测β⁃七叶皂甙钠处理后，脊髓损伤大鼠大脊髓组织AQP4和AQP9的表达，探讨β⁃七叶皂甙钠参与脊髓损伤后水肿形成的机制。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

β⁃七叶皂甙钠（山东绿叶制药股份有限公司生产），羊抗大鼠AQP4、AQP9购于美国Chemico公司，兔抗羊IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。SP免疫组化染色试剂盒与DAB显色试剂盒购于福州迈新公司。

1.2动物分组及模型制备

150只成年健康SD大鼠，按随机数字表法分为随机分为假手术组、脊髓损伤组和β⁃七叶皂甙钠组，每组50只。脊髓损伤模型制备：用10%水合氯醛麻醉大鼠，充分暴露T9～11椎板，暴露脊髓，用自制改良的Allen’s打击器，以重量为3 g的平头撞击器，从3 cm高处自由落体的致伤能量，造成脊髓急性损伤，假手术组仅进行单纯椎板摘除。β⁃七叶皂甙钠组在脊髓损伤动物模型制备后腹腔注射β⁃七叶皂甙钠，5 mg/（kg·d）。术后1、3、7、14、21 d每组各取10只动物进行检测。

1.3大鼠后肢功能行为学测试

运动功能评分：将动物置于测试平台持续观察4 min，记录其后肢活动。0分表示后肢完全瘫痪无活动能力，21分表示运动能力正常。斜板实验：将表面粗糙的橡胶垫固定于斜板上，逐渐增加斜板与水平面之间的角度，直至大鼠刚好可在板上停留5 s，记录这一角度值，每只大鼠测3次，取平均值。

1.4免疫组织化学染色

将大鼠以0.8%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，先以0.9%生理盐水灌流，4%多聚甲醛固定，然后打开椎管，剥离脊髓，置于4%多聚甲醛后固定24 h，常规石蜡包埋，切片（5 μm）。按SP试剂盒说明书测定AQP4和AQP9的表达，以平均光密度值为标准对各组目标蛋白进行评定。

1.5Western blotting检测

将大鼠以0.8%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，冰上取脊髓组织，然后将组织超声粉碎，低温离心1 h，弃去沉淀取上清，用BCA法测定蛋白浓度，绘制蛋白标准曲线，计算每个泳道的上样量。沸水浴将样品变性，上样，电泳，转膜，4℃封闭过夜，一抗、二抗室温孵育2 h，暗室内曝光，显影、定影，对结果进行扫描，然后对结果进行图像分析，以平均光密度值为标准对各组目标蛋白进行评定。

1.6统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计分析，结果用表示，各组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1行为学评价

各时间点脊髓损伤组和β⁃七叶皂甙钠组组BBB评分及斜板实验评分均显著低于假手术组（P＜0.05）；但是自7d开始，各时间点β⁃七叶皂甙钠组大鼠后肢功能恢复情况明显优于脊髓损伤组（P＜0.05），见表1、2。

2.2免疫组化检测结果

表1　3组大鼠运动功能评分比较（n=10，x±s）Tab.1　Comparison of BBB scores among three groups（n=10，x±s）

表2　3组大鼠斜板试验评分比较（n=10，x±s）Tab.2　Comparison of inclined plane test scores among 3 groups（n=10，x±s）

免疫组化结果显示，AQP4与AQP9在假手术组大鼠脊髓组织仅有微量阳性表达，与相同时间点的假手术组相比，脊髓损伤组AQP4与AQP9的阳性表达显著升高（P＜0.01）；与相同时间点的脊髓损伤组相比，β⁃七叶皂甙钠组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的阳性表达则明显降低（P＜0.01）。见图1、2。

2.3Westernblotting检测

图1　免疫组织化学方法检测脊髓损伤7 d后AQP4与AQP9的表达 ×400Fig.1　The expression of AQP4 and AQP9 were detected by immunohistochemical staining at 7 days after SCI×400

图2　各组大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.2　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

Western blotting结果显示，与相同时间点的假手术组相比，脊髓损伤组AQP4与AQP9的蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与相同时间点的脊髓损伤组相比，β⁃七叶皂甙钠组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的蛋白表达则明显降低（P＜0.01）。见图3、4。

3　讨论

脊髓损伤具有很高的发病率和致残率，而且脊髓一旦发生损伤、坏死，恢复的可能性较小，给家庭和社会带来沉重的负担。目前对脊髓损伤的治疗仍然是一个世界性的医学难题［3⁃4］。

图3　Western blotting方法检测AQP4与AQP9的表达Fig.3　The expression of AQP4，AQP9 and β⁃actin detected by Western blotting

七叶皂苷钠是娑罗子果实的提取物，研究［5］发现其具有消肿、抗炎、抗渗出和改善微循环的作用。目前临床主要用于各种原因引起的脑水肿及伴发的脑功能失调、创伤、骨折、手术后引起的肿胀与血肿。研究［6］发现七叶皂苷钠具有很强的稳定血管内皮细胞和消除自由基的作用，另有研究［7］发现，N⁃甲基⁃D⁃天门冬氨酸受体拮抗剂和七叶皂苷钠联合应用对脊髓细胞具有保护作用，能使脊髓组织损害明显减轻，而且在脊髓牵拉损伤前应用七叶皂苷钠对脊髓神经细胞凋亡有抑制作用［8］。综上可知，七叶皂苷钠对脊髓损伤的神经细胞有保护作用。本研究对脊髓损伤大鼠和β⁃七叶皂甙钠组大鼠进行BBB评分及斜板实验评分，结果发现，自7 d开始，相同时间点β⁃七叶皂甙钠组大鼠后肢功能恢复情况明显优于脊髓损伤组，提示β⁃七叶皂甙钠有助于脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，这与之前的研究一致。但是七叶皂苷钠具有多种药理作用，其对脊髓细胞保护作用机制尚不十分清楚。

图4　各组大鼠AQP4和AQP9蛋白的平均光密度值Fig.4　Mean optic density values of AQP4 and AQP9 in each group

AQPs是存在于微生物、动植物和人体内的一组小分子蛋白质，是一种膜通道蛋白，与水电解质的运输平衡密切相关，根据其化学性质又细分为水通道和水甘油通道。AQP4，又名汞不敏感水通道蛋白，在哺乳动物脑和脊髓的星形胶质细胞有广泛表达，在脑水肿、水盐代谢、脑脊液的生成、吸收等方面发挥着重要作用［9⁃10］。研究［11⁃12］发现，降低脊髓损伤部位AQP4的表达能够使急性缺血性损伤时脊髓灰质后角深层的渗透膨胀率明显减少，减轻脊髓水肿的水平，结果提示AQP4与脊髓损伤后的引起的脊髓水肿密切相关。AQP9主要表达于脑和脊髓白质部分的星形胶质细胞，与神经组织中水的转运、中枢渗透压的形成和脑脊液的形成密切相关，还可能与钾离子的代谢、内环境的稳态和脑细胞的能量代谢有关［13］。本研究检测发现，相比于假手术组，脊髓损伤组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的表达显著升高，提示脊髓损伤后，AQP4与AQP9很可能参与了脊髓水肿的形成，但是，但是，β⁃七叶皂甙钠能否通过抑制AQP4与AQP9减轻脊髓水肿，对脊髓损伤后的神经提供保护作用是一个值得思考的问题。本研究建立脊髓损伤模型后，对脊髓损伤大鼠腹腔注射β⁃七叶皂甙钠，然后在不同的时间点处死大鼠，利用免疫组织化学方法和Western blotting方法检测损伤部位脊髓组织AQP4与AQP9的表达，结果发现，与相同时间点的脊髓损伤组相比，β⁃七叶皂甙钠组大鼠脊髓组织AQP4与AQP9的蛋白表达则明显降低。结果提示，下调AQP4与AQP9蛋白的表达很可能是β⁃七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠提供神经保护作用的机制之一。

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（编辑于溪）

Effect of β⁃sodium Aescinate on the Expression of Aquaporin⁃4 and Aquaporin⁃9 in Rats with Spinal Cord Injury

CHEN Yong，CHI Renjie
（Department of Orthopedic，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo study the effect of β⁃sodium aescinate on the expressions of aquaporin⁃4 and aquaporin⁃9 in rats with spinal cord inju⁃ry.MethodsA total of 150 rats were randomly divided into 3 groups：sham group（n=50），spinal cord injury（SCI）group（n=50）and β⁃sodi⁃um aescinate group（n=50）.The experimental animal models was established by modified Allen’s model.The Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）locomotor rating scale and inclined plane test were used to evaluate rat behavioral consequences after injury.The immunohistochemical staining and western blotting assay were performed to observe the expressions of aquaporin⁃4 and aquaporin⁃9.ResultsCompared with sham group，BBB score and inclined plane test score of SCI group and β⁃sodium aescinate group were significantly lower at each time point（P＜0.05）；however，the functional recovery was significantly better in β⁃sodium aescinate group than in SCI group at each time point from 7 d after SCI（P＜0.05）.The aquaporin⁃4 and aquaporin⁃9 positive expressions of rats in sham group were lower significantly than rats in SCI group and β⁃sodium aescinate group（P＜0.05）；however，the aquaporin 4 and aquaporin 9 positive expressions of rats in β⁃sodium aescinate group was lower signifi⁃cantly than rats in SCI group at each time point（P＜0.05）.Conclusionβ⁃sodium aescinate can protect the neurologic function in rats with spi⁃nal cord injury by decreasing aquaporin⁃4 and aquaporin⁃9 protein expression.

spinal cord injury；β⁃sodium aescinate；aquaporin⁃4；aquaporin⁃9；rat

R651.2

A

0258-4646（2016）12-1124-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.015

陈勇（1973-），男，副主任医师，硕士. E-mail：cy730729@sohu

2016-06-17

网络出版时间：