同种异体牙源性骨移植材料修复兔颅骨缺损的实验研究

王媛，王稚英，王明

（锦州医科大学附属第二医院口腔科，辽宁 锦州 121000）

同种异体牙源性骨移植材料修复兔颅骨缺损的实验研究

王媛，王稚英，王明

（锦州医科大学附属第二医院口腔科，辽宁 锦州 121000）

目的通过组织学检测评估兔同种异体牙源性骨移植材料的成骨作用，为口腔种植区骨量不足的修复提供质优价廉的修复材料。方法将兔同种异体离体牙制备成骨移植材料。选用成年健康日本长耳兔28只，建立颅骨缺损模型（3个直径为8 mm的洞形缺损），植入同种异体牙源性骨移植材料作为实验组、人工骨修复材料作为对照组、空白对照组不植入任何材料。取标本前3 d、7 d向兔腹腔注射四环素，分别于术后4、8、12周取标本，进行大体观察、X线检查、制备硬组织切片及HE染色。结果术后4、8和12周的组织形态学分析表明，实验组和对照组的新骨生成量呈递增趋势，且实验组优于对照组，骨小梁结构更为饱满；空白对照组骨小梁结构稀少且变化不明显。结论同种异体牙源性骨移植材料能够很好地促进骨缺损的修复，且成骨效果优于一些人工骨修复材料。

颅骨缺损；同种异体牙源性骨移植材料；人工骨修复材料；成骨作用

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在口腔种植手术中通常会面临牙体长期缺失或牙周炎而造成骨量不足的情况。自体骨移植虽是缺损区成骨的“金标准”［1-2］，但因供骨区术后出现疼痛、出血、疤痕等并发症，患者难以接受。为了解决这一问题，对骨移植材料的研究和应用一直是学者们追踪的热点。理想的骨移植材料应该具备良好的骨诱导性、骨传导性并能促进新骨的生成和重建［3-4］。牙体组织的主要成份为磷灰石晶体、少量蛋白和胶原等有机物，其中，牙釉质中羟基磷灰石含量高达90%以上，较骨组织高。已有韩国口腔种植医生利用牙齿这一特性制备的自体牙骨移植材料应用临床，但国内尚未见类似报道和临床学术交流。本研究拟用同种异体牙制备骨移植材料进行动物实验并探讨其成骨作用，为以后的临床广泛应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物、材料和仪器

健康成年日本大耳白兔28只，体质量2.5～3.0 kg（辽宁医学院实验动物中心提供）；兔离体前牙20个；牙科高速手机；离体牙制骨移植材料加工设备（韩国VacuaSonic LLK⁃3）；硬组织磨片机（德国EXAKT 400CS）；硬组织切片机（德国EXAKT 300CP）；显微镜（Nikon ECLIPSS 38i）；人工骨修复材料（北京奥精医药科技有限公司）；水合氯醛（辽宁医学院实验动物中心提供）；盐酸四环素（成都中牧生物药业有限公司）。

1.2方法

1.2.1制备同种异体牙源性骨移植材料：用牙科高速手机将收集的兔离体牙去除牙石、龋坏组织，并用根管锉去净牙髓后，将其制备成大小2种组织颗粒，大颗粒约0.5～1 mm，小颗粒＜0.5 mm。按照韩国VacuaSonic加工设备的说明书进行操作制备成同种异体牙源性骨移植材料封存备用。

1.2.2实验动物分组、骨缺损模型的建立及材料植入：28只日本长耳兔按术后饲养时间不同随机分成3组，A组4周、B组8周、C组12周。在每只兔的颅骨中缝两侧区域分别钻取3个直径为8 mm的洞形缺损，并保持脑膜完整，3个缺损区分别植入同种异体牙源性骨移植材料作为实验组、人工骨修复材料作为对照组、空白对照组不充填任何材料。术后肌肉注射青霉素（20万U/只）预防感染，并于取材前3 d和7 d腹腔注射四环素（30 mg/kg浓度不超过25 mg/L）做荧光标记。

1.2.3标本制备及观察方法：术后观察实验动物饮食、日常活动能力及术区伤口愈合情况。实验动物处死后取材拍摄X线片。于术后4、8、12周分别处死实验动物，切取颅骨按实验区分别制成1.0 cm× 1.0 cm组织块固定以备用。将各组织块制备成硬组织切片并进行苏木精-伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色于光镜下观察和荧光显微镜下观察。然后每个切片任取5个观察视野进行拍照，用Image⁃Pro⁃Plus 6.0图像分析软件测量图像中新生骨所占面积百分比，每张切片取5组数值的均数作为测量数值。

1.3统计学分析

在统计软件SPSS 19.0中进行配伍组方差分析和组间两两比较，数据以表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1标本的大体观察

术后分别于4、8和12周制取标本，各组标本未见植入材料的移位、脱落等。B组与C组标本中实验组和对照组有骨样组织隆起，用探针探及时其质地与宿主骨组织相似；A组标本中部分实验组表面可见牙体组织颗粒，质地坚硬；空白对照组均呈凹陷状，见图1。

图1　术后12周时的大体标本观察结果Fig.1　Observation of the specimen after 12 weeks

2.2X线检查结果

4周时，实验组和对照组的骨缺损区均可见材料的阻射影像，但密度不均，与周围正常骨组织界限清晰。空白对照组低密度影像明显。8周时，实验组和对照组骨缺损区的阻射影像区域较4周时增大。密度均与正常骨组织相近，界限不清。12周时，实验组和对照组骨缺损区的阻射影像密度较均匀，可见骨小梁结构，部分界限消失与周围骨组织融合。空白对照组缺损边缘可见区域性密度增高影像，但中心部密度仍较低。

2.3组织形态学结果

4周时，实验组和对照组中可见少量骨小梁结构，其周围由淡粉色的类骨质不连续性包绕，成骨细胞排列在类骨质表面呈圆形或椭圆形。实验组中似未吸收材料与骨组织紧密结合共同形成网状支架结构，在材料与骨组织交界处，骨基质将成骨细胞包埋其中。荧光显微镜下观察，2组骨组织表面可见绿色荧光带状新生类骨质，标记线清晰，但双标记间距较窄，提示新骨形成速度较慢。8周时，实验组和对照组中骨小梁结构增多。实验组中粉染类骨质明显多于对照组。荧光显微镜下，实验组绿色荧光带较对照组宽，其间距不明显。12周时，实验组和对照组出现大量新生骨小梁，骨小梁之间骨髓腔隙变窄，边缘可见成骨细胞被自身分泌的基质包埋。实验组似未吸收材料与骨小梁共同形成的网状支架结构广泛而密集。荧光显微镜下观察2组绿色荧光带清晰，但双标记间距仍不明显或融合在一起，见图2、3。

图2　术后12周3组的观察结果 HE×10Fig.2　Observation results of three groups after 12 weeks HE×10

图3　术后12周3组在荧光显微镜下观察结果 ×10Fig.3　Results of three groups under a fluorescence microscope after 12 weeks×10

组织形态学分析测量结果表明，术后4、8和12周的实验组新生骨面积百分比呈递增趋势，且各时间点中实验组优于对照组；空白对照组无明显变化，见表1。统计分析结果表明，各时间点实验组和对照组的新生骨量均明显多于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组新生骨量优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　不同时间各组新骨生成百分比（x±s，n=9）Tab.1　New bone quantity in each group at each time point（x± s，n=9）

3　讨论

治疗颌骨骨组织缺损和牙种植区骨量不足的最好方法是自体骨移植［2］，但是由于自体骨移植存在一定的缺陷，如供骨区的再次损伤、供区的受限、手术时间的延长和术后疼痛等问题，在临床上自体骨移植受到限制。目前人工合成的骨替代材料是临床常用的移植材料，其在口腔种植骨量不足的修复中取得了良好的效果，但是由于价格昂贵，给中低层收入的患者带来不便，限制了口腔种植义齿修复的开展。牙源性骨移植材料是1种新型的移植材料，异体牙齿作为移植材料的优点是来源广泛，并且其无机成分多、有机成分少。常用的异种骨去抗原处理方法有深低温冷冻、反复冻融、煅烧、交联、脱蛋白、辐照或多种方法联合运用［5］。许慧芬等［6］通过实验研究发现应用物理联合化学方法制备的异种骨移植材料具有良好的生物相容性。但是高温煅烧又使材料的力学强度和溶解性降低，同时还会影响新生骨组织细胞的长入［7⁃8］。韩国Cosmobio⁃medicare公司研发了应用复合酸、氯仿、H2O2结合超声震荡的牙源性骨移植材料加工设备，目前已将自体牙加工的材料应用于临床，并取得了很好的临床效果。

本研究考虑到临床工作中往往因为自体牙的丢失或骨缺损较大而使原材料使用受限，而异体牙来源广泛，因而本研究应用兔的同种异体牙进行实验。兔的同种异体牙源性骨替代材料植入后组织愈合良好，无明显排斥反应。在各时期的大体观察结果中，4周时实验组的表面可见白色牙体组织颗粒镶嵌其中，8周和12周时的实验组中牙体组织颗粒不明显或被骨组织包埋。在12周时的硬组织切片观察中实验组的骨小梁结构明显多于8周和4周，且同期的各组间比较，实验组优于对照组，空白对照组均无明显变化。本研究还可发现在各时期实验组中，似未吸收的牙体组织结构未见减少或变化不明显，均匀而广泛地与骨组织紧密结合，期间不存在纤维组织也未见炎症细胞。荧光显微镜下观察，各时期的实验组中绿色荧光带较对照组多，表明实验组的成骨活动广泛存在。以上结果表明牙源性骨替代材料可作为一种支架结构有效促进骨缺损的修复愈合。

本研究结果表明，同种异体牙源性骨移植材料无明显排斥反应，且具有良好的成骨作用，其新骨生成质量和速度较一些临床常见的人工骨修复材料好。因此，同种异体牙源性骨移植材料具有很好临床应用前景。

［1］SHIBUYA N，JUPITER DC.Bone graft substitute：allograft and xe⁃nograft［J］.Clin Podiatr Med Surg，2015，32（1）：21-34.DOI：10.1016/j.cpm.2014.09.011.

［2］JAMES R，DENG M，LAURENCIN CT，et al.Nanocomposites and bone regeneration［J］.Front Mater Sci，2011，5（4）：342-357.

［3］TOMS AD，BARKER RL，JONES RS，et al.Impaction bone⁃grafting in revision joint replacement surgery［J］.J Bone Joint Surg Am，2004，86（9）：2050-2060.

［4］FINKEMEIER CG.Bone⁃grafting and bone⁃graft substitutes［J］.J Bone Joint Surg Am，2002，84（3）：454-464.

［5］陈学英，李宝兴，李靖，等.异种骨移植材料制备及其骨诱导活性实验研究［J］.中国修复重建外科杂志，2009，23（3）：362-365.

［6］许慧芬，何慧宇，唐小雪，等.不同方法制备异种骨支架材料的生物相容性评价［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（47）：8749-8752.

［7］JAHN K，BRAUNSTEIN V，FURLONG PI，et al.A rapid method for the generation of uniform acellular bone explants：a technical note［J］.J Orthop Surg Res，2010，5（1）：32.DOI：10.1186/1749⁃799X⁃5⁃32.

［8］HASHIZUME H，TAMAKI T，OURA H，et al.Changes in the extra⁃cellular matrix on the surface of sintered bovine bone implanted in the femur of a rabbit：an immunohistochemical study［J］.J Orthop Sci，1998，3（1）：42-53.

（编辑于溪）

Experimental Study of the Repair of Rabbit Skull Defects with Allogeneic Tooth Derived Bone Graft Material

WANG Yuan，WANG Zhiying，WANG Ming
（Department of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo evaluate the osteogenesis of rabbit allogeneic tooth derived bone graft material by histological detection，so as to provide quality and cheap repair materials for the repair of bone defects in dental implants.MethodsThe bone graft materials were prepared using rab⁃bits allogeneic extracted teeth.A total of 28 adult Japanese healthy rabbits were selected to establish the cranial defect model with three 8 mm diam⁃eter holes.The allogenic tooth derived bone graft material were implanted into the experimental group.The artificial bone repair material was used as the control group，and the control group did not receive any implantion.Tetracycline labeling was performed after operation，the specimens were taken at 4，8 and 12 weeks after operation，and then the gross observation，X⁃ray examination，preparation of hard tissue sections，and HE staining were carried out.ResultsHistological analysis at 4，8 and 12 weeks after operation showed that there was an increasing trend the new bone for⁃mation in both experimental group and the control group，and the experimental group was better；the trabecular bone structure of the blank group was scarce and the change was not obvious.ConclusionAllogenic tooth derived bone graft materials can promote the repair of bone defect，and the effect is better than that of artificial bone repair materials.

skull defect；allogenic tooth derived bone graft materials；artificial bone repair materials；osteogenesis

R782

A

0258-4646（2016）12-1082-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.006

辽宁省省直医院改革重点临床科室诊疗能力建设项目（LNCCC⁃C10⁃2015）

王媛（1988-），女，硕士研究生.

王稚英，E-mail：wzyfsey@126.com

2016-03-03

网络出版时间：