应用转染细胞研究ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线所致DNA损伤修复的关联

关阳阳，肖明扬，潘亮，3，薛萍，张国培，逯晓波

（1.中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，沈阳 110122；2.本溪钢铁（集团）有限责任公司职业病防治所，辽宁 本溪 117021；3.沈阳市第九人民医院职业病科，沈阳 110024）

应用转染细胞研究ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线所致DNA损伤修复的关联

关阳阳1，2，肖明扬1，潘亮1，3，薛萍1，张国培1，逯晓波1

（1.中国医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，沈阳 110122；2.本溪钢铁（集团）有限责任公司职业病防治所，辽宁 本溪 117021；3.沈阳市第九人民医院职业病科，沈阳 110024）

目的探讨ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线（UVC）所致细胞DNA损伤与修复的关联。方法构建稳定表达ERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）和ERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）2种基因型的质粒，转染中国仓鼠卵巢细胞缺陷型UV5，获得稳定表达ERCC2转染细胞系。应用MTT法比较2种不同基因型转染细胞经不同照射强度UVC处理后细胞抑制率的差别；应用改良彗星试验检测各转染细胞经UVC处理后1、3、6、24 h DNA损伤修复能力的差异。结果与UV5ERCC2（AA）相比，突变型细胞UV5ERCC2（CC）对UVC所致DNA损伤更加敏感，细胞存活率降低（P＜0.05）。改良彗星试验结果显示，UV5ERCC2（CC）细胞DNA损伤程度较UV5ERCC2（AA）严重，且修复UVC所致DNA损伤的能力降低，在20 J/m2UVC处理3、6 h时点的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论ERCC2/XPDrs13181多态C等位基因与UVC所致DNA损伤修复能力下降相关，提示ERCC2/XPDrs13181基因多态性可能在UVC所致DNA损伤修复中具有一定意义。

ERCC2/XPD；单核苷酸多态性；转染细胞模型；短波紫外线；核苷酸切除修复

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日光中的紫外线（ultraviolet，UV）依生物学作用差异可分为长波紫外线（UVA，320～400 nm）、中波紫外线（UVB，280～320 nm）和短波紫外线（UVC，100～280 nm）。大气臭氧层对UVC具有吸收作用，生活在地球表面的人类主要受到UVA和少量UVB的照射，UVC常用于实验室消毒。

日光中的紫外辐射为皮肤癌高发的重要原因之一［1］。紫外线对DNA的损伤作用有直接损伤和间接损伤2种，包括链内交联、链间交联、单链断裂和双链断裂等。研究［2］发现，UVC对皮肤角质形成细胞（HacaT细胞）的DNA损伤较UVA和UVB明显。UVB和UVC的能量可直接被DNA吸收，从而破坏DNA的分子结构，也可因产生过量的活性氧（reactive oxidative species，ROS）对DNA造成间接损伤［3］。对于紫外线所致的DNA损伤，细胞内常见的修复系统是碱基切除修复（base excision repair，BER）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER），其中NER是修复UV所致DNA光损伤的主要途径之一，至少30多种因子参与NER过程。

人类着色性干皮病基因D（xeroderma pigmento⁃sum group D，XPD），又称核苷酸切除修复交叉互补因子2（excision repair cross complementing group 2，ERCC2），位于q13.3，含23个外显子，长约54 300 bp。其编码蛋白XPD是核NER途径的一种重要因子，作为解旋酶在损伤部位打开DNA双链以利于后续修复，对于紫外线所致链间、链内DNA交联损伤具有修复功能［4］；此外，XPD还是组成Ⅱ型转录因子H（transcription factorⅡhuman，TFⅡH）复合物的重要因子，参与p53介导的凋亡反应和一些基础转录过程［5］。

目前已发现ERCC2/XPD的编码区存在多个多态性位点，其中密码子312、751发生变异最为常见，频率约为42%。其多态性可以改变DNA损伤修复能力，与非小细胞肺癌、食管腺瘤、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胆道癌等多种肿瘤的发病密切相关［6］。ERCC2/XPD多态性与紫外辐射的关联研究目前甚少。本研究通过构建ERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）和ERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）2种基因型的质粒转染中国仓鼠卵巢细胞ERCC2/XPD缺失的突变型细胞UV5，获得稳定表达ERCC2/XPD不同基因型的转染细胞。采用MTT细胞抑制率试验、改良彗星试验比较表达不同基因多态转染细胞的细胞生存率及DNA修复损伤能力的差异，探讨该多态在UVC所致的DNA损伤修复过程中的功能意义。为ERCC2/XPDrs13181位点基因多态性与UVC之间可能存在基因—环境交互作用提供新的科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）AA8（CHO野生型）、UV5（CHO突变性，ERCC2表达缺失）购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。

1.1.2主要试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、G418（GiBCO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、5×SDS⁃PAGE、ArcyBis、TEMED、过硫酸铵、低熔点琼脂糖、6⁃磷酸葡萄糖（美国Sigma公司），ERCC2/XPD一抗、β⁃actin一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），RT⁃PCR试剂盒、RT⁃PCR引物（日本TaKaRa公司），基因探针设计（MGB公司）。

1.1.3主要仪器：CO2孵育箱（HF90，力康生物医疗科技控股有限公司），酶标仪（DNM⁃9602G，北京普朗新技术有限公司），倒置显微镜（imt⁃413，日本Olympus公司），短波紫外灯光源［发射波长为200～290 nm，峰值254 nm，辐射强度调整至2.5 J/m2，美国Spectronics（SP）公司SPXX⁃15N］，CF15D低温高速离心机（日本Hitachi公司），GR⁃15S低温超速离心机（美国Beckman公司），Power PAC300普通琼脂糖凝胶电泳仪（美国Bio⁃Rad公司），GDS800凝胶成像分析系统（美国Gene公司），PCR仪（德国BIOMETRA公司），计算机图像分析系统（日本Luzex⁃F公司），Nanodrop核酸定量分析仪（美国Thermo公司），荧光定量PCR仪及相应分析软件（上海Roche公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及处理：中国仓鼠卵巢细胞AA8（野生型）、UV5（突变型，ERCC2/XPD表达缺失）用含10%FBS、10 IU/mL青霉素、10 IU/mL链霉素的DMEM培养基，UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）、UV5GFP转染细胞用含10%FBS，0.5～1 mg/mL G418的DMEM培养基，置于37°C、5%CO2孵育箱中培养。取对数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化后，充分吹打成单细胞悬液后铺板。待细胞贴壁24 h后，用不同强度UVC处理。

1.2.2ERCC2/XPD751位点不同基因型转染细胞的建立：质粒构建、质粒鉴定、细胞转染具体内容已在前期完成［7］，稳定转染的ERCC2/XPD751位点不同基因型细胞经复苏后待用。

为进一步验证检验两变量之间的因果关系，将变量进行格兰杰因果关系检验。两变量LGDP和LTTL存在协整关系，因此，满足检验的前提条件。检验结果见表4。

1.2.3转染细胞的鉴定：

1.2.3.1镜下观察转染效率转染细胞可在含0.5～1 mg/mL G418的DMEM培养基选择生长。在对数生长期时，以荧光显微镜下是否可见表达绿色荧光蛋白的细胞，确定转染效率。

1.2.3.2Western blotting检测ERCC2/XPD蛋白表达提取细胞总蛋白采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量并调整浓度。将样品与5×loading buffer按体积比4∶1混匀后，于100℃加热变性5 min，-80℃冰箱保存备用。取蛋白上样行SDS⁃PAGE电泳。转PVDF膜后，于5%脱脂奶粉/0.1%TBST中封闭过夜。ERCC2/XPD一抗浓度为1/1 000，β⁃actin一抗浓度为1/1 000。室温摇床孵育2 h。用TBST洗膜30 min，5 min/次。二抗浓度为1/8 000。室温摇床孵育1 h。用TBST洗膜30 min，5 min/次。HRP⁃ECL法发光显像。用Image J软件进行灰度值测定，用ERCC2/XPD与β⁃actin的灰度值之比作为ERCC2/ XPD表达的相对含量。

1.2.3.3TaqMan®real⁃time PCR法检测ERCC2/ XPD751位点SNPERCC2/XPDLys751Gln（rs13181）位点引物序列为：Forward5’⁃CAGGAGTCACCAGGA ACCGT⁃3’，Reverse 5’⁃CTCAGCCTGGAGCAGC⁃TAGAAT⁃3’；探针序列为A⁃allele⁃5’⁃FAM⁃ATCCTCTTCAGCGTCT⁃MGBNFQ⁃3’，C⁃allele⁃5’⁃VIC⁃TCCTCTGCAGCGTC⁃MGBNFQ⁃3’。反应体系包括TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL，10 μmol/L引物和探针各0.5 μL，l0 ng/μL基因组DNA 2 μL，超纯水2.5 μL，总体系10 μL。反应过程为95℃l0 min进行Amplitaq酶的活化，92℃15 s变性，60℃1 min退火及延伸，共40个循环。用SDS软件进行分析。

1.2.4DNA损伤修复能力的检测：

1.2.4.1细胞抑制率试验采用MTT比色法测定UVC对UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）转染细胞的细胞毒性。取对数生长期细胞，消化制成单细胞悬液，在96孔板细胞培养皿中接种（5×103/孔）。待细胞贴壁24 h后，用UVC荧光灯照射（非实验组遮盖1层锡箔纸，用以避光），照射剂量强度为0（对照组）、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35 J/m2，每组设6个平行孔，照射后加含10%胎牛血清的DMEM培养液200 μL，置于37℃、5%CO2孵育箱中培养24 h，每孔加5 mg/ mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加DMSO 150 μL，37℃振荡5 min。选择490 nm波长，酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值。以UV强度为横轴，细胞存活率为纵轴，绘制曲线。根据3次独立实验数据，进行统计学分析。

1.2.4.2改良彗星试验取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，吹打为单细胞悬液，接种于6孔板（2×105/孔），待细胞贴壁24 h后，弃去原培养液。分别采用10、20 J/m2照射细胞，照射后继续用含10%胎牛血清DMEM培养液培养1、3、6、24 h，用预冷的PBS重悬细胞，待用。在预备上胶的彗星试验专用载玻片中央滴加100 μL 1%NMA，迅速盖上盖玻片使凝胶均匀，于4℃避光放置10 min。滴加100 μL细胞与1%LMA的混合液（体积比为1∶3），4℃避光放置10 min。将凝胶浸泡在细胞裂解液中（100 mmol/L EDTA⁃Na2，2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris⁃HCl，pH10.5，临用前加入 1%TritonX⁃100和 10% DMSO），4℃避光裂解60 min。然后在电泳液（1 mmol/L EDTA⁃Na2，300 mmol/L NaOH，pH13）中进行DNA解旋30 min。恒压20 V电泳25 min后，用0.4 mol/L Tris⁃HCl漂洗。待凝胶干燥后用20 μg/mL EB染色，ddH2O冲洗。荧光显微镜下观察拍照。用CASP软件进行图像分析，每组观察100个细胞，计算各彗星的Olive尾距，计算DNA损伤程度。根据3次独立实验数据，进行统计学分析。

1.3统计学分析

2　结果

2.1ERCC2/XPD在各转染细胞系中的表达（图1）

图1　3种转染细胞的FITC荧光图像 ×200Fig.1　FITC fluorescence images of three transfected cells×200

ERCC2/XPD rs13181 AA（Lys751）、rs13181 CC（Gln751）质粒以及绿色荧光蛋白空质粒分别同时转染CHO细胞突变型（UV5）。转染细胞可在含0.5～1 mg/mL G418的DMEM培养基中生长。5 d后，如图1所示，荧光显微镜下可见3种表达绿色荧光蛋白的转染细胞UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）以及UV5GFP，确定转染效率均达到80%以上。

2.2Western blotting验证ERCC2/XPD在各细胞中的表达

Western blotting结果如图2所示，转染细胞UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）均出现分子量为87 000的蛋白条带，从而确定这2种转染细胞均表达XPD蛋白，而UV5和UV5GFP未见特异性的蛋白条带。

2.3 转染细胞ERCC2/XPDrs13181基因型的确定

图2　Western blotting检测ERCC2/XPD蛋白表达Fig.2　The expression of ERCC2/XPD protein detected by West⁃ern blotting

根据实时定量PCR曲线判断基因型，如图3所示，UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）细胞DNA鉴定证实ERCC2/XPD751位点基因多态性不同，分别为AA和CC。

2.4UVC对UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）细胞存活率的影响

图3ERCC2/XPD 751位点多态不同基因型结果Fig.3　Detection of ERCC2/XPD coden 751 polymorphism

不同剂量的短波紫外线UVC照射UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）、UV5GFP细胞后，各转染细胞存活率的变化见表1和图4。随着UV强度的增加，各转染细胞存活率逐渐呈下降趋势，具有剂量—反应关系，且与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），表明不同剂量UV的照射对细胞存活率均具有抑制作用。不同照射剂量下，UV5ERCC2（AA）的细胞存活率均大于UV5ERCC2（CC），UV5GFP由于不表达XPD蛋白，细胞存活率最低。且在5、7.5、10、15、20、25 J/m2处理下，不同基因型的转染细胞比较，细胞存活率差异有统计学意义（P＜0.05）。野生型UV5ERCC2（AA）修复UVC损伤能力高于突变型UV5ERCC2（CC），提示ERCC2/ XPD751位点基因多态性与UVC照射引起的细胞毒性存在关联。

2.5UVC所致UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）细胞的DNA损伤与修复

不同剂量UVC照射UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）转染细胞后所致DNA损伤与修复情况见图5和表2。10 J/m2UVC照射UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）细胞后，随着继续培养时间的延长，细胞DNA损伤均不断增加，于照射后6 h最为明显，然而在照射后24 h DNA损伤均有所修复，但与野生型UV5ERCC2（AA）相比，突变型UV5ERCC2（CC）的修复幅度偏小，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。20 J/m2UV照射细胞后所引起的细胞DNA损伤更为明显，在照射后3、6 h，两细胞间的差异存在统计学意义（P＜0.05）。表明ERCC2/ XPDLys751Gln位点在DNA损伤修复过程中存在差异，但差异仅在UVC较大剂量作用下的个别时点存在。

表1　不同剂量UVC照射诱导的UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）细胞存活率（n=6）Tab.1　The cells viability induced by different doses of UVC irradiation in UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）（n=6）

图4　不同剂量UVC照射下UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）、UV5GFP细胞存活率情况Fig.4　cells viability induced by UVC irradiation in UV5ERCC2（AA），UV5ERCC2（CC）and UV5GFP

3　讨论

作为一种进化保守的DNA解旋酶，ERCC2/XPD是NER途径中的重要因子，在NER和碱基转录中具有一定作用，它通过在损伤部位打开DNA双链参与到NER中。ERCC2/XPD蛋白缺失可影响NER能力。人类XPD基因突变可导致DNA修复缺陷性疾病，包括着色性干皮病、毛发营养不良症、Cockayne综合征等。本研究组在前期工作中研究了ERCC2/ XPD基因缺失对UV诱导DNA损伤修复能力的影响，结果发现ERCC2/XPD蛋白缺失细胞对UV诱导的DNA损伤修复能力有显著下降［8］。ERCC2/XPD rs13181（Lys751Gln）是一种常见的基因多态，第751密码子G/A多态导致氨基酸从Lys到Gln的替代，有研究［9］提示rs13181突变型与DNA损伤修复能力密切相关，携带XPD第751密码子Gln/Gln表型的个体修复紫外线嘧啶二聚体的能力比Lys/Lys表型低50%。

本研究通过人类PCR产物了构建ERCC2/XPD rs13181AA（Lys751） 和 ERCC2/XPDrs13181CC（Gln751）2种基因型的质粒，并成功转染ERCC2/ XPD缺失的CHO突变型细胞UV5，获得稳定表达人类ERCC2/XPD不同基因型的转染细胞。采用MTT法比较了经不同剂量UVC照射后UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）转染细胞抑制率，发现UV5ERCC2（CC）细胞比UV5ERCC2（AA）对UVC所致损伤更为严重。说明ER⁃CC2/XPDrs13181位点C等位基因会对UVC所致损伤更为敏感。而彗星试验是DNA损伤评价的较为经典的试验，本研究选用了10 J/m2和20 J/m22个照射剂量，通过彗星试验连续观察UVC照射后1、3、6、24 h各时点细胞DNA损伤修复的动态变化，发现UVC照射后继续培养3 h和6 h时UV5ERCC2（CC）细胞的损伤较UV5ERCC2（AA）细胞严重，而在继续培养24 h后2种细胞虽均有修复，但UV5ERCC2（AA）细胞对损伤的修复程度比UV5ERCC2（CC）细胞更为明显。提示ERCC2/ XPDrs13181基因多态在UVC所致DNA损伤修复中可能具有一定的意义，但研究结论尚待进一步证实。

表2　不同强度UVC照射所致UV5ERCC2（AA）、UV5ERCC2（CC）转染细胞的DNA损伤情况（n=100，x±s）Tab.2　UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）cells DNA damage and repair induced by UVC irradiation（n=100，x±s）

图5　UV5ERCC2（AA）和UV5ERCC2（CC）转染细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳图 ×200Fig.5　Single⁃cell gel electrophoresis of DNA damage in UV5ERCC2（AA）and UV5ERCC2（CC）×200

综上所述，目前对于基因多态性的研究多集中于人群研究的相关分析上，但是对于多态功能的研究却相对局限，本研究尝试应用体外转染细胞模型对ERCC2/XPDrs13181基因多态在UVC所致DNA损伤修复中的差异进行分析，丰富了此类研究的思路与方法。当然，体外试验尚需与人群研究相互结合，才能为DNA修复基因多态能否作为肿瘤生物标志提供更为有力的证据。

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（编辑王又冬）

Association between ERCC2/XPD Polymorphisms and UVC⁃induced DNA Damage Using Transfected Cells Model

GUAN Yangyang1，2，XIAO Mingyang1，PAN Liang1，3，XUE Ping1，ZHANG Guopei1，LU Xiaobo1
（1.Department of Toxicology，School of Public Health，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Dispensary of Occupational Disease，Benxi Steel Group Co.Ltd，Benxi 117021，China；3.Department of Occupational Diseases，The 9th People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo explore the function ofERCC2/XPDpolymorphisms in the repair of DNA damage induced by UVC.MethodsPlas⁃mids stably expressingERCC2/XPDrs13181 AA（Lys751）andERCC2/XPDrs13181 CC（Gln751）were transfected into Chinese hamster ovary cells，and the stable ERCC2 transfected cell lines were obtained.MTT assay was used to compare the inhibitory rates of the transfected cells treated with UVC at different irradiation intensity.The DNA damage repair ability of the transfected cells treated with UVC for 1，3，6 and 24 h was detected by modified comet assay.ResultsCompared with UV5ERCC2（CC），UV5ERCC2（CC）was more sensitive to UVC with decreased cell viability. DNA damage level of UV5ERCC2（CC）cells was more serious than UV5ERCC2（CC）.ConclusionDNA repair capacity ofERCC2/XPDrs13181A allelic is lower than its wild⁃type，suggesting thatERCC2/XPDpolymorphisms play a critical role in UVC⁃induced DNA damage repair.

ERCC2/XPD；single nucleotide polymorphisms；transfected cell model；UVC；nucleotide excision repair

R114

A

0258-4646（2016）12-1066-07

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.003

国家自然科学基金（81273118）

关阳阳（1987-），女，硕士研究生.

逯晓波，E-mail：xblu@cmu.edu.cn

2016-09-26

网络出版时间：