miR⁃200c调控RhoA基因表达介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制的研究

马腾，刘丽波，蔺扬，马珺，薛一雪

（中国医科大学基础医学院神经生物学教研室，沈阳 110122）

miR⁃200c调控RhoA基因表达介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制的研究

马腾，刘丽波，蔺扬，马珺，薛一雪

（中国医科大学基础医学院神经生物学教研室，沈阳 110122）

目的研究miR⁃200c调控Ras基因家族成员A（RhoA）表达介导RMP7增加血肿瘤屏障（BTB）通透性的机制。方法应用real⁃time PCR检测RMP7作用BTB后人脑微血管内皮细（ECs）miR⁃200c的表达；应用miR⁃200c模拟物和miR⁃200c抑制物分别转染GECs（ECs和U87脑胶质瘤细胞共培养的细胞），测量跨内皮阻抗值（TEER）、辣根过氧化物酶（HRP）渗漏量，分析BTB通透性；应用Western blotting检测RhoA的表达；应用免疫荧光方法观察GECs中RhoA表达和分布；应用双荧光素酶报告基因检测miR⁃200c转录后水平调控RhoA机制。结果RMP7作用GECs后，使GECs内源性miR⁃200c表达显著降低；miR⁃200c模拟物和miR⁃200c抑制物成功转染到GECs中；miR⁃200c模拟物显著抑制RMP7诱导TEER值的降低、HRP的升高；miR⁃200c模拟物显著减少RhoA的表达，促使RhoA在GECs细胞质和细胞核分布减少；miR⁃200c模拟物转录后水平负性调控RhoA基因表达。miR⁃200c抑制物与miR⁃200c模拟物实验结果相反。结论miR⁃200c转录后水平负性调控RhoA表达，介导RMP7增加血肿瘤屏障通透性机制。

miR⁃200c；Ras基因家族成员A；RMP7；血肿瘤屏障；基因表达调控

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RMP7为一种人工合成的缓激肽类似物，是特异、强效的缓激肽B2受体激动剂［1］。RMP7与缓激肽和B2受体结合后能够快速短暂开放血脑屏障（blood brain barrier，BBB）和血肿瘤屏障（blood⁃tu⁃mor barrier，BTB）［2⁃3］，同样本研究组前期研究［4⁃5］证明了缓激肽能够开放BTB，并且证明Ras基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）参与RMP7与缓激肽介导BTB通透性的增加，但其具体机制不清楚。

miRNA是其初级转录产物pri⁃miRNA和前体pre⁃miRNA经过一系列核酸酶剪切加工产生的，具有调控功能的非编码小RNA，长约22个核苷酸，人类大约30%的基因受到miRNA的调控［6］。miRNA主要通过种子区与靶基因mRNA 3’非翻译区（3’un⁃translation region，3’⁃UTR）的完全或不完全配对，降解靶基因的mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞增殖、凋亡及分化等生理病理过程［6］。研究［7］证实miR⁃200b和miR⁃200c调控RhoA和Rho相关激酶Ⅱ（Rho associated kinaseⅡ，ROCKⅡ）表达，参与内皮细胞通透性的调节，本研究组前期工作［4⁃5］同样证实了RhoA介导缓激肽开放BTB，进一步应用miRNA靶基因预测软件TargetScan预测，发现RhoA是miR⁃200c的靶基因，因此推测miR⁃200c可能参与RMP⁃7介导的BTB通透性增加过程。

1　材料与方法

1.1材料

NU（Nuserum）血清（BD Biosciences公司），EBM⁃2（Lonza公司），DMEM细胞培养液（Gibco公司），Li⁃pofectamine 3000（Invitrogen公司），RhoA抗体（Ab⁃cam公司）；抗β⁃actin抗体（Santa Cruz公司），羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（北京中山生物技术公司），RMP7、辣根过氧化物酶（horseradish perox⁃idase，HRP；Sigma公司）。miR⁃200c抑制物、模拟物（吉码公司）。

1.2方法

1.2.1脑微血管内皮细胞的培养和体外BTB模型的制作：人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3（human cerebral microvascular endothelial cells line hCMEC/ D3，ECs）由Couraud教授惠赠，培养的方法参照文献［6］。人脑胶质细胞U87和HEK 293 T购于中科院上海细胞库。按照MA等［4，6］的方法建立体外BTB模型。首先，1×106个U87胶质瘤细胞细胞种植在胶原包被的Transwell小室的下层，当细胞融合至80%时，将ECs接种至Transwell小室的上室（大约1×105个细胞）。细胞在共培养7～10 d后融合，此时的细胞叫做GECs（ECs with U87 glioma cells co⁃culturing，GECs）。共培养7～10 d后，加入药物进行后续实验。

1.2.2RMP7的作用和分组：RMP7（5 nmol/L）加到Transwell小室的上室，实验分为6组（每组5例）：RMP7 0 min组、RMP7 5 min组、RMP7 10 min组、RMP7 15 min组、RMP7 30 min组和RMP7 60 min组。

1.2.3细胞转染：转染前24 h，在6孔板中每孔接种5×105个GECs细胞，继续培养。取试剂盒中的P3000试剂5 μL加入含有125 μL EBM⁃2培养基中EP管，将2.5 μg待转染的microRNA与其混合，将Li⁃pofectamine 3000试剂3.75 μL加入另一个装有125 μL EBM⁃2培养基中EP管，两个EP管混合，室温放置5 min，按照说明书转染。

1.2.4跨内皮阻抗值（transendothelial electric resis⁃tance，TEER）的测量：TEER是应用微孔电阻系统在37℃恒温下检测的，最终的TEER值与Transwell小室的表面积相乘计算，单位用Ω·cm2表示。

1.2.5HRP流量测定：将Transwell中与U87细胞共培养的GECs和单独培养的ECs分别转移至1个新的24孔板中。将含有0.5 μmol/L HRP的无血清DMEM培养基加入Transwell小室的上室中。RMP7作用后的特定时间点上收集下室的培养基，并通过色度法测量样品中HRP的含量。HRP流量用通过每平方厘米表面积的皮摩尔（pmol/cm2）数表示。

1.2.6Western blotting检测RhoA蛋白的表达：当Transwell小室的上室的细胞生长到融合时，用含有0.1 mmol/L EDTA的PBS冲洗，细胞铲刮取细胞，倒入1 mL裂解液，4℃匀浆，离心，上清液为蛋白样品液。抗RhoA抗体（1∶300）、抗β⁃actin抗体（1∶800）4℃孵育过夜，在羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG二抗中室温孵育1 h，ECL化学发光、显像，用Chemi Imager 5500 V2.0软件扫描，通过Fluor Chen 2.0软件进行定量分析，测得光密度值（integrated density val⁃ue，IDV）。

1.2.7免疫荧光法观察RhoA蛋白的表达和分布：将生长在盖玻片上GECs单层用4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX⁃100透化，5%BSA封闭，RhoA（抗体稀释浓度1∶150），阴性对照用0.01 mol/L PBS代替一抗，应用FITC标记的荧光二抗（1∶150），避光条件下染色，甘油封片，荧光显微镜观察，采集图像。

1.2.8免疫荧光素酶报告基因实验：分别将miR⁃200c模拟物阴性对照与RhoA野生型重组载体和突变型重组载体共转染至HEK 293 T中。分别设立对照组、阴性对照+RhoA野生型组、miR⁃200c模拟物+ RhoA野生型和miR⁃200c野生型+RhoA突变型组。转染后的HEK293 T细胞应用双荧光素酶试剂盒，按照说明书操作检测荧光素酶相对活性。

1.3统计学分析

2　结果

2.1RMP7降低GECs中内源性miR⁃200c表达

Real⁃time PCR结果显示，RMP7以时间依赖性方式显著降低miR⁃200c表达，RMP7 10 min组miR⁃ 200c表达量最低，显著低于RMP7其他时间组（P＜0.05），此后，miR⁃200c表达量逐渐恢复到原始的表达水平。见图1。

2.2miR⁃200c模拟物和抑制物转染效率测定

Real⁃time PCR结果显示，在miR⁃200c模拟物组，miR⁃200c表达量以时间依赖性方式显著升高，转染后72 h miR⁃200c表达量最高，与对照组和阴性对照组相比其表达量分别上调（7.002±1.105）和（7.019±1.118）倍。在miR⁃200c抑制物组，miR⁃200c表达量以时间依赖性方式显著降低，转染后72 h miR⁃200c表达量最低，与对照组和阴性对照组相比其表达量分别下调（0.220±0.107）和（0.227±0.100）倍。转染后72 h为最大转染率，转染后96 h被认为是收集和使用转染后细胞最佳时间，并用于后续实验。见图2。

图1RMP7对GECs的miR⁃200c表达影响Fig.1　Effect of relative expression of miR⁃200c as detected by RMP7 in GECs

图2　miR⁃200c模拟物和miR⁃200c抑制物转染效率的测定Fig.2　Transfection efficiency for miR⁃200c mimics and inhibitors as detected by quantitative RT⁃PCR

2.3miR⁃200c过表达和表达沉默显著改变BTB的完整性和通透性

与对照组和阴性对照组比较，miR⁃200c模拟物组HRP流量显著降低，TEER值显著升高；miR⁃200c抑制物组HRP流量显著升高，TEER值显著降低。与miR⁃200c模拟物组比较，miR⁃200c抑制物组HRP流量显著升高，TEER值显著降低。见图3。

2.4miR⁃200c过表达和表达沉默显著改变RhoA的表达

图3　MiR⁃200c过表达和表达沉默对BTB的完整性和通透性影响Fig.3　Changes in BTB integrity and permeability after overexpression or silencing of miR⁃200c

与对照组和阴性对照组比较，miR⁃200c模拟物组RhoA表达量显著降低；miR⁃200c抑制物组RhoA表达量显著升高。与miR⁃200c模拟物组比较，miR⁃200b抑制物组表达量显著升高。见图4。

2.5miR⁃200c过表达和表达沉默显著改变RhoA的分布

图4　MiR⁃200c过表达和表达沉默对RhoA表达影响Fig.4　Effect of overexpression or silencing of miR⁃200c on RhoA expression

在GECs中，RhoA在内皮细胞质和细胞核中有表达。MiR⁃200c模拟物组RhoA在细胞质和细胞核中表达减少，miR⁃200c抑制物组RhoA在细胞质和细胞核中表达增多。见图5。

2.6miR⁃200c转录后水平负性调控RhoA基因表达根据生物信息学软件预测（http：//www.tar⁃ getscan.org/），miR⁃200c种子区和RhoA 3’⁃UTR的133⁃139具有结合位点（图6A）。如图6B所示，双荧光素酶报告基因检测显示，与对照组和阴性对照组相比miR⁃200c模拟物组野生型荧光素酶活性显著下降，模拟物组突变型荧光素酶活性没有显著变化。

图5　荧光显微镜观察miR⁃200c过表达和表达沉默对RhoA表达和分布影响Fig.5　Effect of overexpression or silencing of miR⁃200c on the expression and distribution of RhoA in GECs by immunofluorescence analysis

图6　MiR⁃200c转录后水平负性调控RhoA基因表达Fig.6　MiR⁃200c inhibits the expression of RhoA by targeting their 3’⁃UTR

3　讨论

近年来，miRNA的研究越来越收到重视，成为生命科学中的研究热点。MiR⁃200家族根据其在染色体上的定位被分为2个基因组：分布在1号染色体上的miR⁃200ab/miR⁃429基因组，和分布在12号染色体上的miR⁃200c/miR⁃141基因组。也可以根据它们的功能和种子区分为2个亚家族：miR⁃200b、miR⁃200c和miR⁃429具有相同种子区，叫做miR⁃200b/200c/429基因簇；miR⁃200a和miR⁃141具有相同种子区组成miR⁃200a/141基因簇［8］。本研究发现miR⁃200c参与RMP7介导的BTB通透性的改变，同样，有报道miR⁃34c转录后水平负性调控MAZ表达，MAZ调控紧密连接相关蛋白ZO⁃1、occludin和clau⁃din⁃5表达，进而调控BTB通透性的改变。以上研究结果说明某些miRNA和BTB通透性紧密相关［9］。

本研究和我们过去的研究［4⁃5］均证实RhoA参与RMP7与缓激肽介导BTB通透性的增加，RhoA引起F⁃actin细胞骨架重排，紧密连接关蛋白ZO⁃1、occlu⁃din和claudin⁃5重分布，进而引起BTB通透性升高。在本研究中发现miR⁃200c转录后水平负性调控RhoA表达，且miR⁃200c通过种子区与RhoA 3’⁃UTR保守区133⁃139位点结合。有学者［7］发现miR⁃200c转录后水平负性调控RhoA表达介导高级聚糖化终产物（advanced glycation end，AGE）诱导人脐带静脉内皮细胞通透性升高，而且miR⁃200c种子区同样与RhoA 3’⁃UTR保守区133⁃139位点结合，这与我们的研究结果一致。近年来有研究［8］发现miR⁃200b/200c/429基因簇中miR⁃200b也能直接调控PKCα导致细胞骨架F⁃actin重排，这个研究结果部分与我们实验结果不同，可能是由细胞的组织特异性等引起的。

综上所述，miR⁃200c可以转录后水平调控RhoA等分子的表达，进而介导细胞骨架重排，引起BTB通透性改变。

［1］BARTUS RT，ELLIOTT P，HAYWARD N，et al.Permeability of the blood brain barrier by the bradykinin agonist，RMP⁃7：evidence for a sensitive，auto⁃regulated，receptor⁃mediated system［J］.Immu⁃nopharmacology，1996，33（1⁃3）：270-278.

［2］ELLIOTT PJ，HAYWARD NJ，DEAN RL，et al.Intravenous RMP⁃7 selectively increases uptake of carboplatin into rat brain tumors［J］. Cancer Res，1996，56（17）：3998-4005.

［3］BARTUS RT，SNODGRASS P，MARSH J，et al.Intravenous cere⁃port（RMP⁃7）modifies topographic uptake profile of carboplatin within rat glioma and brain surrounding tumor，elevates platinum levels，and enhances survival［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，293（3）：903-911.

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（编辑武玉欣）

miR⁃200c Regulates RMP7⁃mediated Increases of Blood⁃tumor Barrier Permeability by Targeting RhoA

MA Teng，LIU Libo，LIN Yang，MA Jun，XUE Yixue
（Department of Neurobiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo study the mechanism of miR⁃200c in regulating RMP7⁃induced increases of blood⁃tumor barrier（BTB）permeability by targetingRashomolog gene family member A（RhoA）.MethodsEndogenous expression of miR⁃200c was detected by real⁃time PCR in hu⁃man cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3（ECs）after RMP7 treatment.miR⁃200c mimic and miR⁃200c inhibitor were transfect⁃ed into GECs（ECs with U87 glioma cells co⁃culturing），respectively.Transfection efficiency of miR⁃200c mimic and miR⁃200c inhibitor were de⁃termined by real⁃time PCR.HRP flux and TEER assays revealed BTB permeability.The protein expression level of RhoA was assessed by West⁃ernblotting.ThedistributionofRhoAwasassessedbyimmunofluorescencemicroscopy.RhoAluciferaseassayswereperformedusingtheDual⁃Lucif⁃erase reporter assay system.ResultsRMP7 significantly induced a decrease in miR⁃200c expression in GECs of BTB.miR⁃200c mimic and miR⁃200c inhibitor were successfully transfected into GECs.Overexpression of miR⁃200c inhibited endothelial leakage and restored normal transendo⁃thelial electric resistance values.Simultaneously，overexpression of miR⁃200c significantly reduced the protein expression level of RhoA.In addi⁃tion，immunofluorescence analysis revealed that the distribution of RhoA in the cytoplasm and nuclei of GECs were decreased in miR⁃200c mimic group.RhoA was one of the direct targets of miR⁃200c with the specific binding site being located at the seed sequence.The results of miR⁃200c si⁃lencing were opposite to that of the miR⁃200c overexpression group.ConclusionmiRNA⁃200c regulated RMP7⁃induced increases in BTB perme⁃ability by targeting RhoA.

miR⁃200c；RhoA；RMP7；blood tumor⁃barrier；gene expression regulation

R338.2

A

0258-4646（2016）12-1057-06

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.001

国家自然科学基金（81101918；81673028）

马腾（1976-），男，副教授，博士.

薛一雪，E-mail：xueyxiue888@163.com

2016-06-02

网络出版时间：