富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子对施万细胞影响的比较

吴晶洋，白艳洁，王稚英

（1.锦州医科大学附属第二医院口腔种植中心，辽宁 锦州 121001；2.中国医科大学附属盛京医院集团抚顺医院口腔科，辽宁 抚顺113000）

富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子对施万细胞影响的比较

吴晶洋1，2，白艳洁2，王稚英1

（1.锦州医科大学附属第二医院口腔种植中心，辽宁 锦州 121001；2.中国医科大学附属盛京医院集团抚顺医院口腔科，辽宁 抚顺113000）

目的以施万细胞作为周围神经模型，比较富血小板纤维蛋白（PRF）与浓缩生长因子（CGF）对其的影响。方法随机选取18～55岁身体健康志愿者10人，无菌条件下采集静脉血10 mL，制备PRF和CGF。将细胞随机分为对照组、PRF组和CGF组。倒置相差显微镜下观察细胞形态；MTT比色法测定细胞增殖能力；酶联免疫吸附法检测细胞上清液中神经生长因子的分泌量；流式细胞仪检测细胞周期。结果倒置相差显微镜下观察各组细胞形态无明显差异；MTT结果显示PRF组和CGF组与对照组相比光密度值明显升高（P＜0.05），细胞上清液中神经生长因子分泌量均明显升高（P＜0.05），处于S+G2M期的细胞数明显增多（P＜0.01），而PRF组与CGF组相比各项指标的差异无统计学意义。结论PRF和CGF均可以促进施万细胞增殖并增加神经生长因子的分泌量，但就改善细胞增殖能力、促进神经生长因子分泌来看，二者无明显差异。

富血小板纤维蛋白；浓缩生长因子；施万细胞；神经生长因子；细胞周期

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口腔种植技术正处于飞速发展与日益完善的黄金时期，越来越多的牙齿缺失患者放弃了传统镶牙而选择口腔种植修复，后者无论是在美观还是实用性上与传统镶牙相比都有较大优势。牙周膜组织中含有大量鲁菲尼小体，它们是天然牙的机械感受器，对于牙齿缺失的患者来说，牙周膜组织也遭到了不同程度的破坏，这导致了种植体对机械刺激的感受阈值要比天然牙高出许多倍，当种植体所受外力较大时就会造成其周围骨吸收，最终导致种植失败，如何刺激种植体周围神经再生以达到保护种植体免受过度受力所造成的损伤成为解决这一问题的关键［1］。

施万细胞是神经嵴的衍生物，形成了周围神经髓磷脂轴突的髓鞘。每个施万细胞包绕在一个轴突上，沿着轴突节形成一层髓磷脂髓鞘，当一个轴突死亡时，环绕在其周围的多个施万细胞与其基底膜管一起形成一个生长通道，在其尾端形成新的轴突。许多研究［2］证明，施万细胞在周围神经的形成、分化和再生等方面扮演了非常重要的角色。富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）和浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）属于第2代血浆制品，它们在继承了第1代血浆浓缩物富血小板血浆优点的基础上，还表现出了许多令人欣喜的特点。进入21世纪，国内外开始研究PRF在创伤外科、美容外科、口腔种植科以及颅颌面外科等多个医疗再生领域的治疗效果。实验［3］证实PRF可以促进成骨细胞的增殖及分化，加速骨组织愈合，减轻周围组织的炎性反应。研究［4］证明，CGF具有改善并增强组织再生的独特性质，有利于所有再生组织的恢复，是再生医疗领域中组织刺激的新技术。近年来CGF对于神经细胞的作用受到广泛关注。本研究将PRF和CGF作用于施万细胞，比较PRF和CGF对施万细胞的影响，为临床在种植窝预备中下齿槽神经损伤时加快受损伤的神经恢复功能提供思路。

1　材料与方法

1.1细胞、试剂及仪器

施万细胞、施万细胞培养基购自上海中禾新舟生物科技有限公司；多聚⁃L⁃赖氨酸购自上海士锋生物科技有限公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；人神经生长因子ELI⁃SA试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司；Annex⁃in V⁃FITC流式检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；DNM⁃9602G型酶标分析仪购自北京普朗新技术有限公司；Medifuge离心机购自意大利Silfradent公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus公司；高速离心机购自德国Ep⁃pendorf公司。

1.2细胞培养

在T⁃75培养瓶中加入10 mL三蒸水和15 μL的聚⁃L⁃赖氨酸，37℃、5%CO2培养箱中孵育过夜。24 h后用三蒸水冲洗包被了聚⁃L⁃赖氨酸的培养瓶2次，加入15 mL施万细胞培养基，此培养基为完全培养基，将施万细胞冻存管置于37℃水浴箱中，轻轻旋转冻存管至内容物完全溶解后，迅速将冻存管中的液体移入聚⁃L⁃赖氨酸包被的培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5%CO2培养箱中培养，选取对数生长期细胞，换用无血清培养基饥饿培养24 h，待细胞生长周期同步化后进行实验。

1.3PRF和CGF的制备

1.3.1PRF的制备：血液采集自10名健康志愿者，告知实验内容并取得同意后，一次性采集10 mL静脉血置于无添加抗凝剂的真空离心管中，立即放入数字离心机中3 000 r/min离心10 min后，可见血液分为3层，由上到下依次为无细胞血浆层、PRF凝块、红细胞层。在超净工作台中，将PRF凝块放入无菌离心管中，-80℃冰冻1 h，4℃解冻后230g离心10 min，加入5 mL施万细胞培养基，37℃孵育24 h后3 000 r/min离心5min，取上清5 mL即为PRF，0.22 μm滤器过滤后加入5 mL施万细胞培养基，得到10 mL含PRF的培养液［5］。

1.3.2CGF的制备：血液采集自10名健康志愿者，告知实验内容并取得同意后，一次性采集10 mL静脉血置于无添加抗凝剂的真空离心管中，立即放入Medifuge离心机中，设定制备CGF程序，离心10 min后可见血液分为3层，由上到下依次为无细胞血浆层、CGF纤维蛋白层、红细胞层。在超净工作台中，将CGF凝块放入无菌离心管中，-80℃冰冻1 h，4℃解冻后230g离心10 min，加入5 mL施万细胞培养基，37℃孵育24 h后400g离心5 min，取上清5 mL即为CGF，0.22 μm滤器过滤后加入5 mL施万细胞培养基，得到10 mL含CGF的培养液［6］。

1.4实验分组

对照组：用施万细胞培养基培养；PRF组：用含PRF的施万细胞培养基培养；CGF组：用含CGF的施万细胞培养基培养。

1.5倒置相差显微镜下观察细胞形态

将施万细胞以上述方法吹打收集制成单细胞悬液，并以1×106/孔的密度接种于6孔板中，根据各组要求，分别加入相应的培养基培养72 h后，置于倒置相差显微镜下观察各组细胞形态。

1.6MTT法检测细胞增殖率

用施万细胞培养基将施万细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度，按照5×104/孔将细胞接种到96孔板中，每孔体积100 μL，培养板的边缘孔加入等量无水PBS，设置空白对照孔。将96孔板置于恒温37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后去除旧的培养液，按照实验分组，每孔更换对应培养液100μL置于CO2培养箱中培养48 h，各组细胞处理结束前4 h每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，水平摇床上低速混匀1 min继续培养4 h后，吸掉培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，摇床上避光振荡10 min。用酶标分析仪检测570 nm波长处各组细胞的吸光度［7］。

1.7酶联免疫吸附法检测细胞上清液中神经生长因子的分泌量

将施万细胞以上述方法吹打收集制成单细胞悬液，并以1×106/孔的密度接种于6孔板中，根据各组要求，分别加入相应的培养基培养3和5 d后，吸取每孔细胞上清液，2 000g离心20 min，提取上清液，按照试剂盒说明书进行操作。以神经生长因子含量为纵坐标，450 nm处的光密度（optical density，OD）值为横坐标，绘制标准品的标准曲线，根据标准曲线计算各组样品中神经生长因子的含量［8］。

1.8流式细胞术分析细胞周期

将施万细胞以上述方法吹打收集制成单细胞悬液，并以1×106/孔的密度接种于6孔板中，根据各组要求，分别加入相应的培养基培养72 h后，按照试剂盒说明书进行操作，1 h内上流式细胞仪分析细胞DNA含量分布［9］。

1.9统计学分析

2　结果

2.1倒置相差显微镜下观察细胞形态

各组细胞贴壁紧密，突触形成并相互连接，细胞生长状态良好。各组间细胞形态无明显差异。见图1。

2.2MTT法检测细胞增殖能力

图1　相差显微镜下对照组、PRF组和CGF组的细胞形态学改变 ×400Fig.1　Cell morphology observed under inverted phase contrast microscope×400

与对照组相比，PRF组和CGF组的OD值在第1、3、5天均明显升高（P＜0.05），PRF组和CGF组的OD值在第1、3、5天相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2　MTT法检测不同时间段3组的细胞增殖情况Fig.2　Cell proliferation in 3 groups at different time points de⁃tected by MTT method

2.3酶联免疫吸附法检测细胞上清液中神经生长因子的分泌量

检测标准品的OD值，得出回归方程，将各实验组的OD值代入回归方程中。与对照组相比，PRF组和CGF组细胞上清液中的神经生长因子分泌量明显升高（P＜0.05），PRF组与CGF组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.4流式细胞术分析细胞周期

与对照组相比，PRF组和CGF组处于S+G2M期的细胞明显增多（P＜0.01），但PRF组与CGF组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

3　讨论

图3　3 d和5 d时血清中3组的神经生长因子分泌情况Fig.3　Secretion of nerve growth factor in supernatant in 3 groups on 3 d and 5 d

周围神经损伤后远端髓鞘崩解，施万细胞和轴突间的联系消失，大量增殖的施万细胞吞噬损伤末端的髓鞘碎片后形成细胞索，使轴突能够沿其生长并分泌神经生长因子，诱导损伤的神经元分泌相应蛋白使轴突进一步延长；在此过程中施万细胞包裹轴突形成髓鞘，传递神经冲动。由此可见，施万细胞在周围神经损伤后的修复过程中起着非常重要的作用［10］。

图4　3组流式细胞检测结果Fig.4　Cell cycle detected by flow cytometry in 3 groups

PRF属于第2代血小板浓缩制品，制备过程简单，含有大量的纤维蛋白原、高浓缩血小板及多种生长因子。PRF中的生长因子在其降解过程中逐步缓慢释放，具有相对长效的特点。KUMAR等［11］的研究指出，PRF能够明显改善软骨组织的愈合。还有报道［12］指出，PRF在儿童牙髓再生治疗中发挥了很好的疗效。CGF是由SACCO首先研发出来的，CGF的制备过程与PRF略有不同，CGF的生物学作用主要依赖其含有的各种生长因子与纤维蛋白原形成的纤维网状支架。CGF与PRF的不同主要在于其变速制备过程中血小板α颗粒释放出的各种生长因子。CGF可以促进施万细胞的增殖以及神经生长因子的分泌［13］，HONDA等［14］的研究指出，CGF提取物可以促进成骨细胞的增殖和成熟。

本研究通过MTT检测细胞增殖能力发现，PRF组和CGF组均可以提高施万细胞的增殖能力，但2组间的差异不明显。而用ELISA法检测神经生长因子分泌量时，PRF组和CGF组细胞上清液中神经生长因子的分泌量均高于对照组，但2组间的差异不明显。在流式细胞术检测细胞周期的实验中，PRF组和CGF组处于S+G2M期的细胞数较对照组明显增多，但2组间的差异不明显。

总之，PRF和CGF均可以促进施万细胞增殖并增加神经生长因子的分泌量，但就改善细胞增殖能力、促进神经生长因子分泌来看，二者无明显差异。

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（编辑陈姜）

Comparison of Effects of Platelet Rich Fibrin and Concentrated Growth Factor on Schwann Cells

WU Jingyang1，2，BAI Yanjie2，WANG Zhiying1
（1.Center of Dental Implant，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Stomatology，Fushun Hospital，Shengjing Hospital Group of China Medical University，Fushun 113000，China）

ObjectiveTo compare the effects of platelet rich fibrin（PRF）and concentrated growth factors（CGF）using Schwann cells as a pe⁃ripheral nerve model.MethodsA total of 10 healthy volunteers aged 18 to 55 were randomly selected，and 10 mL venous blood was collected un⁃der aseptic conditions to prepare PRF and CGF.The cells were randomly divided into three groups，control group，PRF group and CGF group.The cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope.The cell proliferation was analyzed by MTT assay.The secretion of nerve growth factor in supernatant was detected by enzyme⁃linked immunosorbent assay.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThere was no significant difference of the morphology of cells in each group as observed under inverted phase contrast microscope.MTT results showed that the absorbance values of PRF group and CGF group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The secretion of nerve growth factor in the supernatant were significantly increased（P＜0.05）.The number of cells in S+G2M phase was significantly increased（P＜0.01），but there was no significant difference between PRF group and CGF group.ConclusionBoth PRF and CGF can promote proliferation of Schwann cells and increased the amount of nerve growth factor secretion，but there is no significant difference between PRF and CGF in terms of improving cell proliferation and promoting nerve growth factor secretion.

platelet rich fibrin；concentrated growth factor；Schwann cells；nerve growth factor；cell cycle

R782.12

A

0258-4646（2016）12-1089-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.008

辽宁省科技厅优秀人才培育项目（2014022025）

吴晶洋（1983-）女，硕士研究生.

王稚英，E-mail：bdwzy@126.com

2016-04-15

网络出版时间：