茶园芽孢杆菌QM7促生特性及耐酸铝机制初步研究

罗毅，苏有健，张永利，夏先江，宋莉，王烨军，廖万有

安徽省农业科学院茶叶研究所，安徽 黄山 245000

茶园芽孢杆菌QM7促生特性及耐酸铝机制初步研究

罗毅，苏有健，张永利，夏先江，宋莉，王烨军，廖万有*

安徽省农业科学院茶叶研究所，安徽 黄山 245000

目前含芽孢杆菌等微生物制剂的有机肥料在酸性茶园土壤中的生物活性不高，难以起到有效的促生作用，达到部分替代和减少化肥使用量的目的。本实验分离得到1株耐酸铝芽孢杆菌，命名为QM7。试验发现菌株促生能力受到铝离子浓度的影响，在无铝条件下菌株生长素（IAA）的分泌量为85.6mg·L-1，当铝离子浓度为1mmol·L-1时IAA分泌量为36.8mg·L-1；盆栽结果表明，在6周内菌株可以增加茶苗根系表面积56.8%，根尖数27.3%；蛋白电泳分析发现高浓度的铝胁迫会导致菌株胞内64种与转录、翻译和代谢相关蛋白的表达发生差异，使得菌株生长受到抑制。

茶园土壤；耐酸铝芽孢杆菌；生长素（IAA）；蛋白电泳

茶树〔Camellia sinensis (L.) O. Kuntze〕是典型的喜酸作物，适宜生长的土壤pH值范围为3.2～6.0。长期栽培茶树会导致茶园土壤酸化不断加重，土壤中活性铝的含量显著增高[1]。铝对土壤中绝大多数有益微生物会构成危害[2-3]，不利于有机质的矿化、氮素的固定及土壤养分的转化，是茶园等酸性土壤质量提升的主要障碍因子。近年来随着环境酸化问题的日益严重，特别是化肥的过度使用，加速了土壤酸化及铝的溶出，使得酸性土壤养分失调和生态失衡问题愈加严重[4]。借助耐酸铝微生物的代谢系统对活性铝的适应作用来提高土壤生物活性是未来酸性土壤改良的发展方向之一[5]。

芽孢杆菌（Bacillus spp.）是最常见的根际促生细菌之一，其生理特性丰富多样，对人畜无毒无害，不污染环境，对根系环境具有良好的适应性，因而已被作为防治土传病害，提供植物营养的微生物有机肥类产品而广泛应用于农业生产中[6-7]。一些文献也报道了在茶园中将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）作为生物药剂，防治真菌病害[8-9]。然而，在酸性土壤中，上述菌株由于铝的毒害作用，定殖和促生能力有限。学者通常将对铝的耐受性＞1mmol·L-1的微生物定义为耐酸铝菌[10]，对其中的一些微生物研究发现，铝作用于细胞壁、细胞膜、细胞核和细胞器，影响微生物的物质和能量代谢，抑制微生物的生长。针对这些毒害作用，微生物通过多种途径进行缓解，包括保持细胞壁和膜的完整性和流动性[11]、改变参与三羧酸（TCA）循环途径中不同酶的活性，调节柠檬酸、草酸和苹果酸等有机酸的含量等[12]。目前发现的大多数芽孢杆菌对铝的耐受性低，100μmol·L-1的Al3+就会引起细胞中毒[13]，因此对其耐酸铝机理的报道较少，故加强此方面的研究有助于更广泛地使用芽孢杆菌等根际促生菌制剂在茶树栽培上的应用。

本研究分离出一株耐铝特性较好的促生芽孢杆菌，研究它在茶园土壤中对茶树根系的促生效果和铝胁迫下蛋白表达的差异，旨在为提高芽孢杆菌在酸性茶园土壤环境下的生物活性奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和培养基

1.1.2主要试剂及仪器

细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；聚合酶、T载体和连接酶等均为Takara生物工程(大连)有限公司产品。根系扫描仪10000XL（美国爱普生公司）、超声细胞破碎仪（浙江新芝）、电泳仪（SE-600全套电泳设备，美国GE公司）、光密度扫描仪（美国GE公司）、4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer质谱仪（美国ABI）。

1.2研究方法

1.2.1耐酸铝芽孢杆菌的分离

采集地表下10～30cm深的新鲜土样10g，放入90mL无菌水中振荡10min，70℃水浴15min，转接10mL悬浮液到90mL的S-LB液体培养基（含1mmol·L-1Al3+）中振荡培养过夜，然后吸取培养液涂抹于S-LB固体培养基平板上（含1mmol·L-1Al3+）30℃培养，待有明显的菌落生成，用接种环挑取菌落，按平板划线法分离纯化，直至获得纯菌株。

1.2.2菌株的鉴定

菌株基因组DNA的提取采用试剂盒法，使用通用引物B27F（5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′）和U1492R（5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′）扩增细菌的16S rDNA基因，PCR产物连接到TaKaRa pMD19-T Vector上，转化大肠杆菌E. coli DH 5α进行克隆，经过蓝白斑筛选和B27F和U1492R引物PCR扩增检测阳性克隆和测序。序列在GenBank数据库中检索分析。选取相似菌种的16 S rDNA基因序列下载，构建系统进化树，分析菌株亲缘关系。

在混合料拌和过程中，严格控制拌和楼集料级配，严禁出现随意放料的情况。摊铺和碾压时要严格按照施工工艺进行，压实度要控制在95%～100%范围内，平整度要满足《公路沥青路面施工技术规范》要求，其母体沥青混合料具体质量检查标准如表2所示。

1.2.3菌株QM7促生特性的测定

用Salkowski比色法[14]进行分泌生长素的测定。将菌株培养液（Al3+浓度为0、1mmol·L-1）于10 000 r·min-1，4℃条件下离心10min，取上清液2mL加等量比色液在黑暗中静置30min，立即在波长530nm下测定吸光度。标准曲线采用IAA标准品（Sigma）制作。盆栽试验选取长势一致的茶苗用2%的次氯酸钠表面消毒10min，用无菌水反复冲洗后，每株移栽于5 kg灭菌茶园土壤中（湿热灭菌121℃，2 h），土壤有机质含量17.35g·kg-1，全氮含量1.12g·kg-1，速效磷含量30.46mg·kg-1，速效钾含量85.23mg·kg-1，活性铝含量224.12mg·kg-1，pH4.52。将芽孢杆菌QM7接种于LB培养基中，170 r·min-1，30℃培养48 h，离心去除培养基（6 800 r·min-1，10min），用无菌水水洗两遍离心后，菌体重悬于无菌水，接入菌体到盆栽土壤（通过稀释涂布法确定最终含量为每克土107个菌群），对照加等量无菌水。每个处理20个重复，室外自然生长6周后，测定根长、根直径、根面积和根尖数。

1.2.4菌株QM7耐铝特性的测定

将活化后的细菌培养物离心，无菌蒸馏水洗涤2次，重新悬于无菌蒸馏水中调节A600至1.0，接种环划线接种于含不同铝离子浓度（Al3+：0、1.0、1.5mmol·L-1）的固体S-LB培养基上，以不含铝的S-LB为对照，30℃培养，3 d后观察培养结果。

1.2.5铝胁迫下菌株QM7胞内蛋白表达差异

将对数生长期的菌株QM7培养液分成等量两份离心，并用无菌蒸馏水洗涤2次，分别重悬于Al3+浓度为1mmol·L-1（pH4.5）、0.5mmol·L-1（pH5.0）和无铝（pH 7.0）的S-LB液体培养基中，170 r·min-1，30℃培养30min后离心收集菌体。样品送生工生物工程（上海）公司，按照二维（2-D）蛋白电泳法和质谱串联技术检测[12]。数据经Mascot蛋白数据库比对，离子得分大于63（Ions scores＞63）为阳性结果，选取差异蛋白列表，分析铝胁迫下菌株QM7的响应机制。

1.2.6数据分析

盆栽实验和蛋白电泳实验各设2个重复，两次结果相似。实验数据使用SPSS，version 17.0软件进行方差分析和多组样本间差异显著性分析（Duncan’s multiple range tests, P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1耐酸铝芽孢杆菌的分离和鉴定

用pH 4.5，Al3+浓度为1mmol·L-1的培养基做筛选培养基，结合70℃水浴15min，从10份不同的茶园土壤样品中最终分离得到1株耐酸铝特性较好的细菌菌株，命名为QM7。菌株形态及革兰氏染色结果表明QM7为杆状阳性菌。16 S rDNA测序后，所得序列均已提交到GenBank（登录号：KM894175）。通过与GenBank中的已知序列进行BLAST比对后发现，与数据库中枯草芽孢杆菌的16 S rDNA序列相似度为99%，根据比对结果，将DNA序列与已发表的相关序列进行系统进化分析（图1）。

2.2菌株QM7促生特性的测定

采用Salkowski比色法判断菌株是否分泌生长素。结果表明，菌株QM7的培养液可以与显色液结合呈现粉红色，说明它具有生长素分泌能力。生长素定量测定结果表明，1mmol·L-1铝胁迫导致菌株生长素的分泌量由对照的（85.6±8.2）mg·L-1减少至（36.8±9.6）mg·L-1，较对照减少了57.0%，差异极显著（P＜0.01）。根系扫描结果（表1）显示，种植6周后QM7处理的茶苗根系与对照相比有显著增长，同时根面积增加56.8%，根尖数增加27.3%，而对根系直径的促进效果不显著，表明QM7可以有效地促进茶苗侧根的发育，有利于扦插茶苗的生根。

图1　基于菌株QM7的16 S rDNA序列构建的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16 S rDNA sequences of strains QM7 using the neighbor-joining method

表1　根生长测定Table 1 Rootgrowth assay

2.3菌株QM7耐铝特性的测定

分别用铝浓度为0、1.0、1.5mmol·L-1的S-LB培养基测定QM7对铝的耐受能力。结果表明，铝离子会影响QM7的生长，但在铝离子浓度为1mmol·L-1时菌落仍可以生长，当铝离子浓度达到1.5mmol·L-1时则完全抑制了菌株生长（图2）。说明菌株QM7有一定的耐铝特性，对铝离子的耐受浓度介于1.0～1.5mmol·L-1之间。

2.4铝胁迫下菌株QM7胞内蛋白表达差异

蛋白电泳图谱（图3）显示，与对照相比铝处理后的菌株QM7有64种胞内蛋白的表达量呈现差异变化，随着铝离子浓度的增加部分蛋白如电泳点号为8119、2134和2410等的浓度逐渐增加，点号为4225、4118和4115等蛋白的浓度逐渐减少。切胶测序结果见表2，从表2中可以看出7种蛋白表达量增加10倍以上，4种蛋白的表达量仅为对照的1/4（P＜0.01）。蛋白序列比对后分析发现，差异蛋白主要由分子伴侣、响应调控因子、代谢酶、复制、转录和翻译等构成。对结果的研究发现，通过改变参与三羧酸（TCA）循环途径中不同酶的活性，调节柠檬酸、草酸和苹果酸等有机酸的含量螯合铝可能是QM7响应铝胁迫的主要机制之一。然而，铝对菌株QM7的DNA和蛋白的毒害作用仍不可避免，复制延长因子（FusA）和核糖体蛋白（RplA L1 and L6）受到铝离子的影响，会导致复制和翻译过程中错误率的增加。

图2　S-LB培养基上QM7生长情况Fig. 2 QM7growth on S-LB medium

表2　MALDI-TOF肽指纹图谱识别铝胁迫下QM7胞内差异蛋白Table 2 Identification of changed proteins of strain QM7 under Al- stress using MALDI-TOF peptide mass mapping

3 结论与讨论

茶园土壤中，活性铝的含量较高，导致促生微生物的数量较少，生物活性作用不明显[15-16]，阻碍了茶园生态系统的健康发展。大多数细菌的耐铝能力往往较弱，当铝浓度达到100μmol·L-1甚至50μmol·L-1时，就能够抑制短根瘤菌（Bradyrhizobium spp.）的生长[17]。本实验所用菌株QM7在1mmol·L-1铝浓度下仍能生长，具备了耐酸铝细菌的基本特征，但其生长素的分泌量在铝作用下显著下降，因此促生效果低于赵青云等对中性土壤中促生菌的研究结果[18-19]。目前在茶园中用微生物有机肥料部分替代化肥对茶叶促生和增产的报道还较少，推测其原因是多数根际促生菌株在铝胁迫下生长和代谢能力受到抑制，导致生长素的合成能力下降，促生效果不明显[13]。

图3　QM7胞内蛋白电泳图Fig. 3 Intracellular protein electrophoresis of QM7

近年来对芽孢杆菌响应外界环境胁迫的机理研究发现，酸、热和养分胁迫下，菌株通过增强乙酰辅酶A和调控因子σB的表达调节糖代谢途径来缓解环境压力[20-21]。除此之外，糖异生过程FadN蛋白的上调使得更多的脂肪酸进入TCA循环中[22]。柠檬酸、草酸和苹果酸对铝的螯合能力大于其他有机酸类，因此调节上述有机酸含量，是菌株改变对铝耐受能力的有效手段之一。同时，QM7通过上调乙酰乙酸乙酯酶（Adc）、2,6-α氧化还原酶（AcoA）、NADH丁醇脱氢酶（YugJ）去除TCA循环中的副产物[23]。从能量代谢的角度分析，铝离子通过模拟Fe3+干扰TCA循环和氧化磷酸化等细胞代谢过程，降低电子传递链组分复合物酶的活性，使得细胞处于缺能状态。QM7可能通过α-酮戊二酸脱氢酶（OdhA），将琥珀酰辅酶A转化成琥珀酸，这一过程是底物水平磷酸化，在保证细胞能量需求的同时，还提供了一种螯合铝的产物——草酸[24]。此外铝离子还是一种助氧剂，能使细胞内ROS分子显著增加[25]，为缓解氧化作用，QM7通过OdhA酶的作用提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和α-酮戊二酸清除ROS的能力[26]。然而，如何通过上述反应提高缓解铝毒的有效率还需进一步实验研究。

本研究分离得到一株芽孢杆菌QM7，利用茶园土壤盆栽实验发现菌株QM7对茶树幼苗的根系有良好的促生作用，从它对铝离子胁迫的响应推测，QM7是通过加强三羧酸循环和能量代谢途径缓解铝的毒害作用。本研究为将来通过调节土壤养分，刺激相关胞内代谢从而进一步提高芽孢杆菌在酸性土壤中的适应能力和相关菌剂在茶树促生方面的应用奠定研究基础，但芽孢杆菌是否存在其他途径来适应酸、铝胁迫环境，保持其生物活性尚待以后研究。

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Research on The Promoting Effects on Tea Growth and Aluminum Tolerant Mechanism of Bacillus subtilis Strain QM7

LUO Yi, SU Youjian, ZHANG Yongli, XIA Xianjiang, SONG Li, WANG Yejun, LIAO Wangyou*
Tea Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

At present, the biological activities of Bacillus.spp and other microorganisms in the acid teagarden soil are not high, thereby difficult to effectively promote plantgrowth and replace or reduce the usage of chemical fertilizer. In this study, one of Aluminum (Al) tolerance strains, Bacillus subtilis QM7 was isolated from teagarden soil. The auxin (IAA) production of QM7 was influenced by Al concentration (from 85.6mg·L-1to 36.8mg·L-1under 0 to 1mmol·L-1external Al respectively). Results of pot experiment showed that strain QM7 could promote plantgrowth by increasing root surface area by 56.8% and numbers of root tips by 27.3% in 6 weeks. Two-dimensionalgel electrophoresis (2-DE) was used to identify proteins involved in Al toxicity-induced changes. Results showed that more than 64 proteins differentially expressed in response to Al stress, including proteins involved in DNA transcription, protein translation and cell envelope, which reduced thegrowth of Bacillus subtilis.

tea planting soil, aluminum tolerance Bacillus subtilis, auxin (IAA), two-dimensionalgel electrophoresis

S154.3；Q939.1

A

1000-369X（2016）06-567-08

2016-04-07

2016-07-26

国家茶叶产业技术体系土壤肥料岗位项目（CARS-23-07B）、安徽省农业科学院科技创新基金项目（16A0823）、安徽省现代农业茶产业技术体系茶树栽培岗位项目（2016N1820）。

罗毅，男，助理研究员，博士，主要从事茶园土壤微生物研究。*通讯作者：savetheday@163.com