磁性石墨烯-液质联用测定鸡肉中万古霉素和喹诺酮
2016-12-15董彦莉刘卉闵李超马晶军崔晓娜
董彦莉,刘卉闵,李超,马晶军,崔晓娜
(1.河北农业大学 理学院,河北 保定 071000;2.山东畜牧兽医职业学院 食品药品科技系,山东 潍坊 261061)
磁性石墨烯-液质联用测定鸡肉中万古霉素和喹诺酮
董彦莉1,刘卉闵1,李超1,马晶军1,崔晓娜2
(1.河北农业大学 理学院,河北 保定 071000;2.山东畜牧兽医职业学院 食品药品科技系,山东 潍坊 261061)
建立了鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留的磁性石墨烯固相萃取-液相色谱-串联质谱分析方法.样品采用乙腈提取,磁性石墨烯粉分散固相萃取净化,经Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm ×100.0 mm,1.8 μm)色谱柱分离,液相色谱-串联质谱仪进行检测.目标物在2.0~50.0 μg/L内线性关系良好(r2>0.99).鸡肉基质中目标化合物在5、10、25 μg/kg加标水平的回收率为71.2%~98.8%,相对标准偏差(RSD)为6.8%~14.3%.该方法净化效果好,回收率高,精密度好,可用于鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留检测.
磁性石墨烯固相萃取(MSPE);液质联用法;万古霉素;喹诺酮类
万古霉素(vancomycin)是由链霉菌产生的、结构复杂的糖肽类抗生素,由于万古霉素具有严重耳毒性及肾毒性[1],因此只宜在其他抗生素对病菌无效时才会被短期使用于抢救,农业部560号公告规定万古霉素为禁用兽药.喹诺酮类(quinolones,QNs)药物是一类抗菌作用强的人工合成抗菌药.近年来,该类药物在动物源性食品中残留的现象普遍存在,从而危害人类健康.为了对QNs类兽药残留实施监控,许多国家纷纷制定出喹诺酮在动物性食品中的限量[2].美国FDA规定了家禽肉中的部分QNs的限量.日本批准使用的QNs仅有恩诺沙星、二氟沙星、奥比沙星、达氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和噁喹酸[3].中国农业部发布的235号和236号公告亦对QNs的限量作了规定[4].目前检测万古霉素和喹诺酮类药物的方法很多,包括高效毛细管电泳、高效液相色谱及液质联用技术等.质谱检测器具有高灵敏度和选择性,定性、定量准确,适合进行多组分兽残的快速检测.
磁性石墨烯由氧化石墨烯化学制备而成,不仅保持了氧化石墨烯优越的吸附性能,同时具有磁性,能在外加磁场的作用下快速从样品溶液中分离,因此,非常适合作为固相萃取的吸附剂[4-6].
本文采用实验室制备磁性石墨烯最常用的共沉淀法(氧化还原法)和溶剂热法,并进行了综合改进来进行磁性石墨烯的制备[7-10],采用制备的磁性石墨烯进行前处理净化,建立了鸡肉中万古霉素和10种喹诺酮类药物的液相色谱串联质谱检测方法,方法简便,快速,灵敏度高,重现性好,为打击兽药非法添加提供了技术支持.
1 材料与方法
1.1 试剂和材料
1.1.1 试剂
标准物质万古霉素、麻保沙星、伊诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、双氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星-D8,均购自DR.公司,纯度大于99%.
乙腈、甲醇均为色谱纯(Fisher);无水硫酸钠,分析纯(烟台市双双化工);甲酸,色谱纯(TEDIA);水,GB/T 6682规定的一级水;磁性石墨烯,实验室制备;硫酸铜,优级纯(天津市北联精细化学品开发有限公司);1-(2-吡咯偶氮)-2-萘酚(PAN),分析纯(北京化学试剂有限公司).
1.1.2 仪器
液相色谱质谱联用仪(Agilent1290-6460);分析天平:感量0.1 mg和0.01 g各1台;离心机(5810型、Eppendorf公司);均质器(T25型,IKA公司);振荡器(MMV-1000 W,ETELA公司);氮吹仪(N-EVAP);涡流混匀器(IKA MS basic).
1.1.3 标准溶液配制
万古霉素、麻保沙星、伊诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、双氟沙星、沙拉沙星:用乙腈溶解,按纯度标示折算配制成100 μg/mL的标准储备液.
环丙沙星-D8(内标): 用乙腈溶解,按纯度标示折算配制成100 μg/mL的标准储备液.
1.2 实验方法
1.2.1 样品提取
准确称取(2.00±0.02)g待测鸡肉样品置于50 mL离心管中,加入2 g氯化钠(NaCl)和10 mL乙腈,均质2 min,10 000 r/min离心10 min,待净化.
1.2.2 样品净化
称取10 mg磁性石墨烯于10 mL离心管中,取6 mL上清液(1.2.1)入离心管中,置于振荡器上振荡2 min.用磁铁将磁性石墨烯聚集到离心管底部,将上清液转入5 mL离心管中,氮气吹干,流动相定容至1 mL,过0.22 μm滤膜,进行HPLC-MS/MS测定分析.
1.2.3 液相色谱条件
色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm);柱温:40 ℃,流速:0.3 mL/min,进样量:20 μL;流动相(体积分数):A.0.1%甲酸水,B.乙腈,梯度洗脱程序(体积分数):0→3.0 min,由10%B→30%B;3.0→5 min,由30%B→70%B;5.0→7.0 min,由70%B→90%B;7.01 min,10%B,平衡3 min.
1.2.4 质谱条件
电离方式:ESI+;扫描方式:多反应监测(MRM);干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:10 L/min;喷雾针压力:0.2758 MPa;电子倍增器电压:4 000 V;碰撞气:高纯氮,99.999%,12种化合物质谱参数见表1.
表1 12种化合物的质谱参数
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 色谱柱的选择
喹诺酮类药物在极性方面相近,色谱分离方面要尽可能选择合适的色谱柱,以提高色谱柱分离速度和灵敏度,在色谱柱的选择性方面,选用粒径1.8 μm填料的色谱柱,分别比较Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 系列1.8 μm填料,柱长分别为2.1 mm×50 mm、2.1 mm×100 mm、3.0 mm×100 mm,以及C18与C8(1.8 μm,3.0 mm×100 mm)2种相同规格,不同性质的色谱柱,综合比较了分离效率、灵敏度,柱长为3.0 mm×100 mm C18更好一些.同时选用1.8 μm的填料,使得柱体单位体积内的表面积大大增加,柱效显著提高,使用0.3 mL/min的柱流速与电喷雾离子化方式所要求的流速具有良好的匹配.
2.1.2 流动相的选择
2.1.2.1 流动相组分的选择
为获得最佳的分辨率和灵敏度,分别选用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%(体积分数)甲酸水溶液、乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸铵、甲醇/10 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相,在电喷雾源ESI+方式下,在乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水溶液组成的流动相中,质谱的离子化效率优于其他试剂,因此本文选择乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水作为流动相.
2.1.2.2 梯度洗脱条件的选择
分别将初始流动相比例调整为40∶60、30∶70、20∶80、10∶90,经多次进样分离结果表明:初始流动相中有机相的体积分数占10%,梯度变化有机相渐变,目标物峰形较好,分离时间较短,梯度变化过快会导致麻保沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、环丙沙星出峰出现重叠.在本文的梯度洗脱条件下,12种化合物的出峰情况见图1.
图1 12种化合物的总离子流谱图Fig. 1 Chromatogram of vancomycin and quinolones
2.2 质谱条件的选择
万古霉素属于糖肽类大分子抗生素,通常以盐酸盐形式存在,极性较强.分别在正离子模式和负离子模式下进行质谱离子优化,发现在正离子模式下响应值较高,流动相中加入甲酸后质谱离子化效率更佳.万古霉素分子质量为1 449.263 5,因其带双电荷,母离子扫描在正离子模式下724.9响应较高,符合解离规律.子离子扫描时分别在100~1 000、1 000~1 500内进行,发现m/z144.1,m/z1 143.9响应较高,如图2所示.
图2 分别在100~1 000、1 000~1 500内子离子扫描图Fig. 2 Daughter scan in 100~1 000 and 1 000~1 500
2.3 方法的线性、精密度、检测限和定量限
按照本方法所确定的实验条件,分别在空白鸡肉样品中添加质量浓度为2.0~50 μg/L的标准溶液,其峰面积Y与对应的质量浓度X(μg/L)在此范围内呈现良好的线性关系,2种净化方法的相关系数如表2所示.按10/1的信噪比计算最低定量限,按3/1的信噪比计算万古霉素的检出限(LOQ)为0.050 mg/kg,喹诺酮类物质的最低检出限(LOQ)为0.005 mg/kg.
表2 鸡肉中万古霉素和喹诺酮类物质的回归方程、相关系数、回收率和变异系数
2.4 磁性石墨烯前处理方法与传统方法的比较
磁性石墨烯比表面积大,相对于较传统的QuEChERS方法 C18、PSA、NH2、石墨净化方法固相萃取净化技术用量少[11-12],但净化效果更佳,能够实现高通量样品分析,溶剂消耗少,样品制备简便、快捷.比较了同一加标浓度下,采用磁性石墨烯净化处理,与采用传统QuEChERS方法净化的鸡肉样品的HPLC-MS/MS测定结果,如表3所示.
表3 磁性石墨烯与QuEChERS净化方法比较分析
3 结论
将自制的磁性石墨烯作为前处理净化材料,建立了鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留的液相色谱-串联质谱分析方法.磁性石墨烯固相萃取净化法较传统QuEChERS方法,具有用量少、净化效果好、回收率高的优点,使鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物的检测限和定量限均降低.本文建立的磁性石墨烯固相萃取-液质联用法测定万古霉素和10种喹诺酮类药物残留方法,简便,灵敏度高,回收率高,精密度好,适用于鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物的同时检测.
[1] 冼燕萍,陈立伟,罗海英,等.UPLC-MS/MS法测定猪肉中万古霉素和去甲万古霉素[J].分析测试学报,2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004. XIAN Y P,CHEN L W,LUO H Y,et al.Quantitative determination of vancomycin and norvancomycin in pork by u ltra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2013,32(2): 162-167.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.004.
[2] ZHENG J,HUANG X R,LI Y P.Determination of remained enrofloxacin in eel by eLISA [J].Food Science,2004,25(10):247-250.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.10.060.
[3] 王柯,王艳艳,赵东保,等.HPLC法测定金银花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J].河南大学学报(自然科学版),2011,41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009. WANG K,WANG Y Y,ZHAO D B,et al.Determination of the contents of luteolin and luteoloside in different parts of lonicera japonica by HPLC[J].Journal of He nan University (Natura1 Science),2011,41(1):39-43.DOI:10.3969/j.issn.1003-4978.2011.01.009.
[4] LIU Q,SHI J B,ZENG L X,et al.Evaluation of graphene as an advantageous adsorbent for solid-phase extraction with chlorophenols as model analytes[J].Journal of the Chromatography A,2011,1218(2):197-204.DOI:10.1016/j.chroma.2010.11.022.
[5] LIU Q,SHI J B,SUN J T,et al.Graphene and graphene oxide sheets supported on silica as versatile and high-performance adsorbents for solid-phase extraction[J].Angewandte Chemie International Edition,2011,50(26):5913-5917.DOI:10.1002/anie.201007138.
[6] LUO Y B,SHI Z G,GAO Q,et al.Magnetic retrieval of graphene: Extraction of sulfonamide antibiotics from environmental water samples[J].Journal of Chromatography A,2011,1218:1353-1358. DOI:10.1016/j.chroma.2011.01.022.
[7] HUMMERS W,OFFEMAN R.Preparation of graphite oxide[J].Journal of the American Chemical Society,1958,80(6):1339.DOI:10.1021/ja01539a017.
[8] STAUDENMAIER L.Verfahren zur darstellung der graphitsaure[J].Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft,1898,31(2):1481-1487.DOI:10.1002/cber.18980310237.
[9] BRODIE B C.Surle poids atomique du graphite[J].Annual Review of Physical Chemistry,1860,59: 466-472.
[10] ZHOU Y,BAO Q L,TANG L A L.Hydrothermal dehydration for the green reduction of exfoliated graphene oxide to graphene and demonstration of tunable optical limiting properties[J].Chem Mater,2009,21:2950-2956.DOI:10.1021/cm9006603.
[11] 贾其娜,赵广超.石墨烯固相微萃取纤维的制备及对多氯联苯的检测[J].分析测试学报,2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004. JIA Q N,ZHAO G C.Preparation of graphene-based solid phase microextraction fiber and Its determination of polychlorinated biphenyls[J].Journal of Instrumental Analysis,2015,32(5):541-546.DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2013.05.004.
[12] 丁葵英,许文娟,李凯,等.液相色谱-串联质谱法研究涕灭威及其代谢物在白菜中的动态行为[J].色谱,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018. DING K Y,XU W J,LI K,et al.Dynamic behavior of aidcarb and its metabolites in cabbage by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Chromatography,2016,34(2):165-169.DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.08018.
(责任编辑:梁俊红)
Determination of vancomycin and QNs residues in chicken by graphene based-MSPE-liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry
DONG Yanli1,LIU Huimin1,LI Chao1,MA Jingjun1,CUI Xiaona2
(1.College of Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China;2.Department of Food and Drug Science and Technology, Shandong Vocational Animal Science and Vetevinary College,Weifang 261061,China)
A method for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken was developed using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).The sample was extracted with acetonitrile and purified using MSPE as the sorbent.The target compounds were separated on a Agilent ZORBAX SB-C18 column (3.0 mm×100 mm,1.8 μm) before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that high correlation coefficients (r2>0.99) of the analyses were obtained within their respective linear ranges.The average recoveries and the relative standard deviations ranged from 71.2% to 98.8% and 6.8% to 14.3% respectively at the spiked levels of 5,10,25 μg/kg in chicken.This method is reliable,and suitable for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken.
graphene MSPE;liquid chromatography mass spectrometry;vancomycin;quinolones
10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.006
2015-03-15
河北省科技支撑计划项目(14227115D);山东省潍坊市科技支撑计划项目(2015GX044)
董彦莉(1981—),女,河北鹿泉人,河北农业大学副教授,主要从事分析化学方面的研究. E-mail:dyl19810314@126.com
O652
A
1000-1565(2016)05-0480-07