磁性石墨烯-液质联用测定鸡肉中万古霉素和喹诺酮

董彦莉，刘卉闵，李超，马晶军，崔晓娜

(1.河北农业大学 理学院，河北 保定 071000；2.山东畜牧兽医职业学院 食品药品科技系，山东 潍坊 261061)



磁性石墨烯-液质联用测定鸡肉中万古霉素和喹诺酮

董彦莉1，刘卉闵1，李超1，马晶军1，崔晓娜2

(1.河北农业大学 理学院，河北 保定 071000；2.山东畜牧兽医职业学院 食品药品科技系，山东 潍坊 261061)

建立了鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留的磁性石墨烯固相萃取-液相色谱-串联质谱分析方法.样品采用乙腈提取，磁性石墨烯粉分散固相萃取净化，经Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm ×100.0 mm，1.8 μm)色谱柱分离，液相色谱-串联质谱仪进行检测.目标物在2.0～50.0 μg/L内线性关系良好(r2>0.99).鸡肉基质中目标化合物在5、10、25 μg/kg加标水平的回收率为71.2%～98.8%，相对标准偏差(RSD)为6.8%～14.3%.该方法净化效果好，回收率高，精密度好，可用于鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留检测.

磁性石墨烯固相萃取(MSPE)；液质联用法；万古霉素；喹诺酮类

万古霉素(vancomycin)是由链霉菌产生的、结构复杂的糖肽类抗生素，由于万古霉素具有严重耳毒性及肾毒性[1]，因此只宜在其他抗生素对病菌无效时才会被短期使用于抢救，农业部560号公告规定万古霉素为禁用兽药.喹诺酮类(quinolones，QNs)药物是一类抗菌作用强的人工合成抗菌药.近年来，该类药物在动物源性食品中残留的现象普遍存在，从而危害人类健康.为了对QNs类兽药残留实施监控，许多国家纷纷制定出喹诺酮在动物性食品中的限量[2].美国FDA规定了家禽肉中的部分QNs的限量.日本批准使用的QNs仅有恩诺沙星、二氟沙星、奥比沙星、达氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和噁喹酸[3].中国农业部发布的235号和236号公告亦对QNs的限量作了规定[4].目前检测万古霉素和喹诺酮类药物的方法很多，包括高效毛细管电泳、高效液相色谱及液质联用技术等.质谱检测器具有高灵敏度和选择性，定性、定量准确，适合进行多组分兽残的快速检测.

磁性石墨烯由氧化石墨烯化学制备而成，不仅保持了氧化石墨烯优越的吸附性能，同时具有磁性，能在外加磁场的作用下快速从样品溶液中分离，因此，非常适合作为固相萃取的吸附剂[4-6].

本文采用实验室制备磁性石墨烯最常用的共沉淀法(氧化还原法)和溶剂热法，并进行了综合改进来进行磁性石墨烯的制备[7-10]，采用制备的磁性石墨烯进行前处理净化，建立了鸡肉中万古霉素和10种喹诺酮类药物的液相色谱串联质谱检测方法，方法简便，快速，灵敏度高，重现性好，为打击兽药非法添加提供了技术支持.

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

1.1.1 试剂

标准物质万古霉素、麻保沙星、伊诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、双氟沙星、沙拉沙星、环丙沙星-D8，均购自DR.公司，纯度大于99%.

乙腈、甲醇均为色谱纯(Fisher)；无水硫酸钠，分析纯(烟台市双双化工)；甲酸，色谱纯(TEDIA)；水，GB/T 6682规定的一级水；磁性石墨烯，实验室制备；硫酸铜，优级纯(天津市北联精细化学品开发有限公司)；1-(2-吡咯偶氮)-2-萘酚(PAN)，分析纯(北京化学试剂有限公司).

1.1.2 仪器

液相色谱质谱联用仪(Agilent1290-6460)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g各1台；离心机(5810型、Eppendorf公司)；均质器(T25型，IKA公司)；振荡器(MMV-1000 W，ETELA公司)；氮吹仪(N-EVAP)；涡流混匀器(IKA MS basic).

1.1.3 标准溶液配制

万古霉素、麻保沙星、伊诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、双氟沙星、沙拉沙星：用乙腈溶解，按纯度标示折算配制成100 μg/mL的标准储备液.

环丙沙星-D8(内标): 用乙腈溶解，按纯度标示折算配制成100 μg/mL的标准储备液.

1.2 实验方法

1.2.1 样品提取

准确称取(2.00±0.02)g待测鸡肉样品置于50 mL离心管中，加入2 g氯化钠(NaCl)和10 mL乙腈，均质2 min，10 000 r/min离心10 min，待净化.

1.2.2 样品净化

称取10 mg磁性石墨烯于10 mL离心管中，取6 mL上清液(1.2.1)入离心管中，置于振荡器上振荡2 min.用磁铁将磁性石墨烯聚集到离心管底部，将上清液转入5 mL离心管中，氮气吹干，流动相定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，进行HPLC-MS/MS测定分析.

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm)；柱温：40 ℃，流速：0.3 mL/min，进样量：20 μL；流动相(体积分数)：A.0.1%甲酸水，B.乙腈，梯度洗脱程序(体积分数)：0→3.0 min，由10%B→30%B；3.0→5 min，由30%B→70%B；5.0→7.0 min，由70%B→90%B；7.01 min，10%B，平衡3 min.

1.2.4 质谱条件

电离方式：ESI+；扫描方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；喷雾针压力：0.2758 MPa；电子倍增器电压：4 000 V；碰撞气：高纯氮，99.999%，12种化合物质谱参数见表1.

表1 12种化合物的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

喹诺酮类药物在极性方面相近，色谱分离方面要尽可能选择合适的色谱柱，以提高色谱柱分离速度和灵敏度，在色谱柱的选择性方面，选用粒径1.8 μm填料的色谱柱，分别比较Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 系列1.8 μm填料，柱长分别为2.1 mm×50 mm、2.1 mm×100 mm、3.0 mm×100 mm，以及C18与C8(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)2种相同规格，不同性质的色谱柱，综合比较了分离效率、灵敏度，柱长为3.0 mm×100 mm C18更好一些.同时选用1.8 μm的填料，使得柱体单位体积内的表面积大大增加，柱效显著提高，使用0.3 mL/min的柱流速与电喷雾离子化方式所要求的流速具有良好的匹配.

2.1.2 流动相的选择

2.1.2.1 流动相组分的选择

为获得最佳的分辨率和灵敏度，分别选用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%(体积分数)甲酸水溶液、乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸铵、甲醇/10 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，在电喷雾源ESI+方式下，在乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水溶液组成的流动相中，质谱的离子化效率优于其他试剂，因此本文选择乙腈/0.1%(体积分数)甲酸水作为流动相.

2.1.2.2 梯度洗脱条件的选择

分别将初始流动相比例调整为40∶60、30∶70、20∶80、10∶90，经多次进样分离结果表明：初始流动相中有机相的体积分数占10%，梯度变化有机相渐变，目标物峰形较好，分离时间较短，梯度变化过快会导致麻保沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、环丙沙星出峰出现重叠.在本文的梯度洗脱条件下，12种化合物的出峰情况见图1.

图1 12种化合物的总离子流谱图Fig. 1 Chromatogram of vancomycin and quinolones

2.2 质谱条件的选择

万古霉素属于糖肽类大分子抗生素，通常以盐酸盐形式存在，极性较强.分别在正离子模式和负离子模式下进行质谱离子优化，发现在正离子模式下响应值较高，流动相中加入甲酸后质谱离子化效率更佳.万古霉素分子质量为1 449.263 5，因其带双电荷，母离子扫描在正离子模式下724.9响应较高，符合解离规律.子离子扫描时分别在100～1 000、1 000～1 500内进行，发现m/z144.1，m/z1 143.9响应较高，如图2所示.

图2 分别在100～1 000、1 000～1 500内子离子扫描图Fig. 2 Daughter scan in 100～1 000 and 1 000～1 500

2.3 方法的线性、精密度、检测限和定量限

按照本方法所确定的实验条件，分别在空白鸡肉样品中添加质量浓度为2.0～50 μg/L的标准溶液，其峰面积Y与对应的质量浓度X(μg/L)在此范围内呈现良好的线性关系，2种净化方法的相关系数如表2所示.按10/1的信噪比计算最低定量限，按3/1的信噪比计算万古霉素的检出限(LOQ)为0.050 mg/kg，喹诺酮类物质的最低检出限(LOQ)为0.005 mg/kg.

表2 鸡肉中万古霉素和喹诺酮类物质的回归方程、相关系数、回收率和变异系数

2.4 磁性石墨烯前处理方法与传统方法的比较

磁性石墨烯比表面积大，相对于较传统的QuEChERS方法 C18、PSA、NH2、石墨净化方法固相萃取净化技术用量少[11-12]，但净化效果更佳，能够实现高通量样品分析，溶剂消耗少，样品制备简便、快捷.比较了同一加标浓度下，采用磁性石墨烯净化处理，与采用传统QuEChERS方法净化的鸡肉样品的HPLC-MS/MS测定结果，如表3所示.

表3 磁性石墨烯与QuEChERS净化方法比较分析

3 结论

将自制的磁性石墨烯作为前处理净化材料，建立了鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物残留的液相色谱-串联质谱分析方法.磁性石墨烯固相萃取净化法较传统QuEChERS方法，具有用量少、净化效果好、回收率高的优点，使鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物的检测限和定量限均降低.本文建立的磁性石墨烯固相萃取-液质联用法测定万古霉素和10种喹诺酮类药物残留方法，简便，灵敏度高，回收率高，精密度好，适用于鸡肉中万古霉素和喹诺酮类药物的同时检测.

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(责任编辑：梁俊红)

Determination of vancomycin and QNs residues in chicken by graphene based-MSPE-liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry

DONG Yanli1，LIU Huimin1，LI Chao1，MA Jingjun1，CUI Xiaona2

(1.College of Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.Department of Food and Drug Science and Technology, Shandong Vocational Animal Science and Vetevinary College，Weifang 261061，China)

A method for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken was developed using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS).The sample was extracted with acetonitrile and purified using MSPE as the sorbent.The target compounds were separated on a Agilent ZORBAX SB-C18 column (3.0 mm×100 mm，1.8 μm) before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that high correlation coefficients (r2>0.99) of the analyses were obtained within their respective linear ranges.The average recoveries and the relative standard deviations ranged from 71.2% to 98.8% and 6.8% to 14.3% respectively at the spiked levels of 5，10，25 μg/kg in chicken．This method is reliable，and suitable for the determination of vancomycin and quinolones residues in chicken.

graphene MSPE；liquid chromatography mass spectrometry；vancomycin；quinolones

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.006

2015-03-15

河北省科技支撑计划项目(14227115D)；山东省潍坊市科技支撑计划项目(2015GX044)

董彦莉(1981—)，女，河北鹿泉人，河北农业大学副教授，主要从事分析化学方面的研究. E-mail:dyl19810314@126.com

O652

A

1000-1565(2016)05-0480-07