核酸检测技术在细菌性食源性疾病监测中的应用探讨

刘 威

（营口市老边区疾病预防控制中心检验科，辽宁 营口 115005）

核酸检测技术在细菌性食源性疾病监测中的应用探讨

刘 威

（营口市老边区疾病预防控制中心检验科，辽宁 营口 115005）

目的 探讨常规PCR酸检测技术在细菌性食源性疾病监测中的应用。方法 采用培养法以及常规PCR培养菌中的沙门菌，使用PCR扩增产物序列以确定病原菌种类。结果 常规PCR对于腹泻样本检测结果与培养法一致均检测出沙门菌。检测时间PCR 16 h、PCR产物直接测序19 h时间短于培养法。结论 对于腹泻样本沙门菌检测常规PCR同培养法一样准确，并且所耗时间短，可以应用于食物中毒的快速检测。

细菌性食源性疾病；PCR；PCR扩增产物序列

随着人类生活方式以及行为的改变，新的病原菌不断产生，食源性疾病呈增长趋势。严重危害着人类的健康，成为较为严重的共众卫生问题。对于食源性微生物的致病微生物的快速检测就成了研究的重点。PCR的检测基础为特异的核酸序列扩增，导致体外生长不在是鉴定微生物的必须条件，从而使检测时间缩短。本文为一起皮蛋引起的食物中毒事件，采取两种方法检测其致病菌，即培养法和PCR。

1　材料与方法

1.1一般资料

1.1.1样品：样品来至2014年9月由疑似皮蛋引起的食物中毒事件，患者诊断为急性腹膜炎、急性细菌性痢疾，其中肛试4份（临床处理，两人未采取治疗，两人进行治疗）。呕吐物1份（患者己进行治疗），皮蛋（1份为自家皮蛋，1份为患者服用的皮蛋）。

1.1.2标准菌株：德尔卑沙门菌（CMCC50719）。

1.1.3所用试剂：上海之江生物制剂有限公司提供：沙门菌PCRmix、琼脂糖；北京路桥公司提供：HE琼脂、Mac琼脂、GN肉汤、MM肉汤、SC肉汤。

1.1.4实验仪器：PCR仪（PTC-200）、电泳仪、水平电泳槽（泰能科技有限公司）、紫外透射仪（上海精科实业有限公司）、低温高速冷冻离心机（Hettich公司）、恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2实验方法

1.2.1培养法：将样本与标准菌株分别接种在GN肉汤、MM肉汤、SC肉汤内，之后画线于HE和Mac琼脂板上。

1.2.2PCR法：①模板制备：取1 mL样品，离心2 min，采取的转数为13000 r/min，弃上清液，在沉淀物中加入100 μL的1 DNA提取液，充分摇匀，100 ℃保温箱内静置10 min，13000 r/min[MS2]离心5 min，取上清液。②引物设计：InvA为沙门菌的靶基因，长度为316bP，序列：A1：5'-AACAGTGCTCGTTTACGACC -3'，A2：5'-CCAGGCTATCGCCAATAAC-3。③PCR扩增：反应体系40 μL，在36 μLPCR检测混合液中加入0.4 μL霉，振荡数秒后离心3000 r/min数秒，加入4 μL处理后的标本进行PCR扩增反应。④电泳检测：扩张产物在2%的琼脂糖凝胶电泳30 min，使用30 nm的紫外线灯进行观察。

表1　分化培养结果

2　结 果

常规PCR使用10 h增菌，6 h培养后得到致病菌。培养法则需要增菌18 h之后进行分离，5 d后得到结果。

2.1培养法。见表1。

2.2PCR法：扩张结果见图1。

图1　沙门菌PCR扩增结果

3　讨 论

与传统的采用培养法用来检测致病菌的方法相比，PCR技术对于致病菌的检测更加的快速、灵敏、特异[1]，但是多数采用的是人工模拟样本，对于使用在细菌性食源性疾病病原菌检测的报道较为罕见[2]。PCR检测出病原菌的主要原理为可以针对病原微生物的特异性靶基因，在非特异性扩张未出现时，由于碱基数目较少，检测不全面，因此结果的准确性很难保证。但是随着研究的不断升入，经过几年的积累，病原微生物几乎所用的序列均被解析，因此大大的提高了PCR检测病原菌的准确性[3]。本次实验，培养法得到结果的时间长于PCR。培养法在患者食用的皮蛋中检测出沙门杆菌，PCR未检出，可能与培养法所耗时间长有关系，而增菌液中的目的菌未达到PCR方法的检出限（PCR为105Copies/mL）。从结果中可以看出，PCR从患者的肛拭、粪便中检测出病原菌的时间为10 h甚至可以更短。

综上所述，通过PCR可以在短时间内检测出病源样品内的致病菌，证明核酸技术的可行性，并且优点颇多，可以考虑在临床上推广。

[1]黄薇,赵翔,唐晓雯,等.核酸检测技术在细菌性食源疾病检测中的应用探讨[J].现代预防医学,2011,38(2):344-345.

[2]陈棋炯,丁水军,孙永祥,等.实时荧光PCR技术在预防性健康检查沙门菌与志贺菌检测中的应用[J].中国卫生检验杂志,2015, 25(12):1937-1938.

[3]王琳,江鹏吃,李贻汉,等.荧光PCR在基层从业人员带菌检测中应用的可行性评价[J].中国卫生检验杂志,2013,23(3):664-666.

Application of Nucleic Acid Detection Technology in Bacterial Foodborne Disease Surveillance

LIU Wei
(Department of Laboratory, Yingkou Laobian Distinct Center for Disease Control and Prevention, Yingkou 115005, China)

Objective To explore the application of PCR detection of pathogenic bacteria for food -borne disease. Methods By culture method and the conventional PCR cultures of salmonella, using PCR amplification product sequence to determine pathogenic bacteria species. Results PCR for detection result is consistent with the culture method of samples of diarrhea detect salmonella. Testing time PCR 16 hours, PCR products sequencing19 hours, Shorter than culture method. Conclusion For samples of diarrhea of salmonella detection PCR andreal-time PCR with culture method as accurate, can be applied to the rapid detection of food poisoning.

Bacterial food borne pathogen; PCR; PCR products sequencing

R155.5

B

1671-8194（2016）31-0032-02