泽泻+车前子复方对大鼠尿草酸钙结石形成的影响

翟新宇 丁 毅 赵建华*

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

泽泻+车前子复方对大鼠尿草酸钙结石形成的影响

翟新宇 丁 毅 赵建华*

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

目的 研究泽泻+车前子复方水提取液对实验性大鼠尿草酸钙结石形成的影响，确定其抑制肾脏草酸钙结石的形成并具有保护肾功能的作用。方法 通过喂服泽泻+车前子复方不同浓度的水提取液对乙二醇和1α羟基维生素D3诱导的大白鼠肾草酸钙结石模型进行实验研究。结果 乙二醇和1α羟基维生素D3诱导能显著提高大鼠尿草酸钙结石模型大鼠血BUN、Cr、24 h尿Ox、尿Ca2+分泌量及肾Ca2+含量，但对血P3+、尿Mg2+和肾Mg2+无明显变化；不同剂量药物组大鼠肾Ca2+含量、24 h尿Ca2+分泌量、尿Ox、肾组织的草酸钙结晶及肾小管扩张均明显低于草酸钙结石模型组（P＜0.05），药物组大鼠血P3+、尿Mg2+和肾Mg2+和草酸钙结石模型组间无明显差异。结论 泽泻+车前子复方水提取液能抑制实验性大鼠体内肾草酸钙晶体的形成并具有保护肾脏功能的作用。

尿石；草酸钙；泽泻；车前子；大鼠

尿石症是常见的泌尿外科疾病之一，它既是一种历史古老的疾病又是一个现代医疗上的重要问题。在流行病调查中，国际上每年有10万新发病人数，然而实际住院治疗者仅占该病的25%，其他多数患者在院外治疗[1]。在中国，中医药治疗结石已经成为院外治疗的主要手段之一。

在中医中，泌尿系结石归属于“淋”。淋者有五：热淋、石淋、血淋、膏淋和劳淋。泌尿系结石属于“石淋”和“血淋”的范畴。隋《诸病源候论》中说：“石淋者，淋而出石也，其病之状，小便则茎里痛，尿不能足出，痛引少腹，膀胱里急，沙石从小便道出，甚者塞痛。”临床以肾绞痛和血尿为主症，后期亦可引起肾功能不全。中药以“清利湿热、利尿通淋”为治疗泌尿系结石的方法，多采用如滑石、泽泻、车前子、石韦、灯心草、地肤子等作为药方中的主要成分用于泌尿系结石的治疗。

泽泻（Alisma）为植物泽泻的干燥块茎，味甘、淡、性寒，归肾、膀胱经，利水渗湿、泄热通淋。主小便不利；热淋涩痛；水肿胀满；泄泻；痰饮眩晕；遗精。可与多种中草药配伍组成治疗尿路结石的传统方剂，如猪苓汤、五苓散等。小川等[2]研究证实猪苓汤具有排石和体外抑制草酸钙结晶的作用，认为猪苓汤主要是通过降低尿草酸排泄量而抑制实验性大鼠尿草酸钙结石形成。尹春平等[3]在乙二醇和1α羟基维生素D3诱导的实验性大鼠肾草酸钙结石模型中，发现泽泻水提取液能明显抑制大鼠尿草酸钙结石形成，同时泽泻水提取液对草酸及钙的代谢没有影响。李浩勇、刘继红[4]等发现泽泻水提取液高剂量组可明显降低肾组织Ca2+的含量，对24 h尿Ca2+也有减少的趋势，一定程度上减轻肾小管扩张和草酸钙结晶的形成。

车前子（Plantago）为植物车前的干燥成熟种子，味甘、微寒，归肝、肾、肺、小肠经，清热利尿、渗湿通淋、明目、祛痰。用于水肿胀满，热淋涩痛，暑湿泄泻，目赤肿痛，痰热咳嗽。《本草新编》所载：车前子，味甘、咸，气微寒，无毒。入膀胱、脾、肾三经。功专利水，通尿管最神，止淋沥泄泻，能闭精窍，祛风热，善消赤目，催生有功。但性滑，利水可以多用，以其不走气也。邵绍丰[5]等在对单味中药金钱草、石韦、车前子对大鼠肾结石肾保护作用的研究中发现车前子能预防肾结石，保护肾功能，其作用可能是通过增加尿中草酸钙结晶的排泄，减少其在肾内堆积而达到的。

1　材料与方法

1.1材料、主要试剂、仪器：泽泻生药材：上海市曙光医院中药房，产地福建，批号110907；车前子生药材：上海市曙光医院中药房，产地吉林，批号120701；枸橼酸钾溶液（上海曙光医院药房自制0.1 g/mL，批号：110903）；阿法骨化醇片（重庆药友制药有限责任公司，0.25 μg阿法骨化醇（1-α（OH）VitD3）/片）；HC-9600型火焰原子吸收分光光度计，附计算机一台及FAAS软件（上海荆和分析仪器有限公司产，上海中医药大学中医系提供）；FJ-200可调高速分散机（江苏仪器有限公司）；低速离心机（张家港离心机制造有限公司生产）；偏光显微镜NIKON 1100（上海中医药大学组织学系提供）。

1.2实验方法

1.2.1泽泻+车前子复方有效成分不同浓度的制备：按泽泻∶车前子=9∶15的比例（药典上最大常用量的比例），称取100 g泽泻和166.8 g车前子，采用煎煮法，煎煮3次，每次2 h，加水量分别为2.35、1.7、1.4 L。过滤，合并滤液。滤液浓缩至500 mL，得浓度为0.2 g/mL的药液（以泽泻生药量计）。取50 mL 0.2 g/mL的药液，用蒸馏水定容至100 mL，得浓度为0.1 g/mL的药液。

表4　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿草酸分泌量、尿钙、尿镁含量及肾组织钙、镁含量的结果（，n=10）

表4　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿草酸分泌量、尿钙、尿镁含量及肾组织钙、镁含量的结果（，n=10）

注：与A组相比1）P＜0.05；与B组相比2）P＜0.05

组别　　尿Ox(mmol/24 h)　　尿Ca2+(mmol/24 h)　　尿Mg2+(mmol/24 h)　　肾Ca2+(mg/g)　　肾Mg2+(mg/g) A 0.218±0.027　0.34±0.04　0.50±0.06　2.73±0.90　0.96±0.09 B 0.416±0.0331)2)　0.85±0.061)　0.46±0.09　10.42±2.221)　0.93±0.07 0.324±0.0351)2)　0.55±0.071)2)　0.48±0.06　6.11±2.391)2)　0.85±0.17 D 0.322±0.0211)2)　0.50±0.061)2)　0.47±0.07　7.09±2.531)2)　0.90±0.11 E 0.295±0.0441)2)　0.56±0.081)2)　0.51±0.08　6.95±2.981)2)　0.91±0.18 F 0.298±0.0361)2)　0.46±0.051)2)　0.53±0.08　5.81±1.271)2)　0.89±0.07 C

1.2.2动物分组及给药方法：SD健康雄性大鼠60只（上海中医药大学实验动物中心提供），体质量180～220 g，随机分为6组，每组10只，在清洁级环境下饲养。购买后适应性饲养一周，A组继续使用常规饲料和水喂养28 d，B至F组在试验期间的28 d内灌胃给予诱石剂（1%乙二醇（EG）饮水＋隔天灌胃1 mL 0.5 μg/mL 1α-羟基维生素D3），诱导成为大鼠尿草酸钙结石模型。具体分组如下：A组：空白对照组；B组：模型对照组；C组：阳性对照组（枸橼酸钾0.5 g/kg）；D组：低剂量组；E组：中剂量组；F组：高剂量组，具体情况见表1。

表1　各组大鼠在实验期间给药情况

1.2.3观察指标及检测方法：实验结束前一天用代谢笼收集尿液，测量24 h尿量并用pH计测尿pH，将收集的尿液装入一次性尿瓶中，加入浓盐酸防止尿液腐化（浓盐酸能使尿液中的化学成分及细胞延迟破坏，加入的量为1 mL/dL）测24 h尿草酸（Ox）的分泌量（离子色谱法）。断颈处死大鼠，下腔静脉穿刺取血4 mL（抗凝），离心（3500 r/min）后，取上层血清测血BUN，Cr，P，Ca2+含量。切取双肾，纵向剖开，取左侧肾脏用10%中性福尔马林固定，作常规HE石蜡切片和Von-Kossa's染色，偏光显微镜观察肾组织草酸钙结晶形态分布及肾组织的病理改变，原子吸收光谱仪进行右肾组织Ca2+，Mg2+含量，尿总Ca2+，Mg2+含量测定。

1.2.4统计学分析：采用SPSS18统计软件，数据以（）表示，组间比较用单因素方差分析检验各组间差异显著性，P＜0.05为有统计意义。

2　结 果

2.1泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿量，尿pH的影响：各组的尿量和pH值见表示，B，C，D，E，F组和A组相比，尿量显著增加（P＜0.05），而B，C，D，E，F组之间并没有显著性差异，表明造模是有意义的。各组尿液的pH值并没有显著性差异。见表2。

2.2泽泻+车前子不同剂量组对大鼠血生化的影响：大鼠24 h后血清中BUN，Cr，Ca2+，P的含量见表3。B，C，D，E，F组和A组相比，BUN和Cr显著增加（P＜0.05），C，D，E，F组和B组比较，BUN和Cr明显降低（P＜0.05）；A，B，C，D，E，F组中的Ca2+和P3+没有显著性差异。

表2　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿量、尿pH的影响（，n=10）

表2　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿量、尿pH的影响（，n=10）

注：与A、B、C组相比1）P＜0.05

组别　　尿量(mL)　　尿pH A 15.00±2.60　6.46±0.10 B 40.50±3.221)　6.63±0.21 C 38.63±3.571)　6.81±0.29 D 37.93±4.631)　6.42±0.24 E 38.88±3.161)　6.44±0.20 F 39.25±3.021)　6.38±0.18

表3　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠血生化的影响（，n=10）

表3　泽泻+车前子不同剂量组对大鼠血生化的影响（，n=10）

注：与A组相比1）P＜0.05；与B组相比2）P＜0.05

组别　BUN(mmol/L)　Cr(μmol/L)　Ca2+(mmol/L)　P3+(mmol/L) A　6.58±0.92　30.60±4.51　2.85±0.09　3.81±0.56 B　17.34±3.871)　54.04±6.351)　2.77±0.18　3.60±0.62 C　10.38±1.961)2)　45.26±5.911)2)　2.88±0.16　4.10±0.76 D　9.74±1.981)2)　39.66±4.041)2)　2.65±0.23　3.54±0.60 E　8.30±1.101)2)　38.61±4.241)2)　2.73±0.21　3.86±0.82 F　7.93±1.641)2)　35.17±6.281)2)　2.74±0.18　3.68±0.37

2.3泽泻+车前子不同剂量组对大鼠24 h尿草酸分泌量、尿钙、尿镁含量及肾组织钙、镁含量的结果：大鼠24 h尿草酸分泌量、尿钙、尿镁含量及肾组织钙、镁含量的结果见表4，B，C，D，E，F组和A组相比，尿Ca2+，尿Ox和肾Ca2+显著增加（P＜0.05），C，D，E，F组和B组比较，尿Ca2+，尿Ox和肾Ca2+显著降低（P＜0.05）；各组中的尿镁和肾镁都没有明显变化。

2.4病理学分析：肉眼观：A组大鼠肾脏表面光滑，呈鲜红色，色泽一致。切开可见明显的皮、髓质分界，组织结构紧凑清晰，触之光滑。除A组大鼠外，其余各组肾脏均有不同程度肿大（B组大鼠尤为明显），呈苍白色，色泽暗淡。B组大鼠肾脏切开后可见皮髓质分界模糊，皮质变薄，结构组织疏松，触之有明显的磨砂感。C，D，E，F组大鼠肾脏皮髓质分界较清晰，组织结构欠紧凑，触之没有明显的磨砂感。各组大鼠肾脏标本在偏光显微镜下所呈现的图像，见图1。（在NIKON偏光显微镜下观看，放大倍数均为10倍，从左至右分别为A，B，C，D，E和F组大鼠镜下观）。

3　讨 论

在泌尿系结石中，草酸钙结石约占80%。尚旭明等[6]认为，绝大多数结石含有草酸钙成分，检出率为98%。近年来，中药辅助预防结石在尿排石过程中发挥着越来越巨大的作用，泽泻、车前子作为传统利水排石的配方之一，其排石机制正在被越来越多的专家学者所研究证实。自日本学者栗田[7]等首先报道泽泻具有排石和体外抑制草酸钙结晶的作用后，日本学者Utsunomiya等[8]对组成猪苓汤的多种单味中药在体外对草酸钙结晶的生长，而且抑制活性很强（晶体生长抑制指数达到80%以上）。Yamaguchi[9]和刘继红、尹春萍等[4]在EG和1α-羟基维生素D3诱导的实验性大鼠草酸钙模型中发现泽泻提取物能有效抑制草酸钙结石的形成，尹春萍等[10]还发现在体外的研究实验证明泽泻水提取液能有效抑制草酸钙晶体的生长和自发性结晶，并随着人工尿液的离子强度降低和pH值的升高，其抑制活性随之增强，推测其作用机制可能是由于低离子强度和高pH值时，泽泻水提取液吸附于草酸钙晶体表面的能力增强，从而抑制晶体的聚集生长。邵绍韦等[5]在对单味中药金钱草、石韦、车前子对大鼠肾结石肾保护作用的实验研究中证实车前子能预防肾结石、保护肾脏的作用，可能主要是通过增加尿中草酸钙结晶的排泄，减少其在肾内堆积而达到的。

图1　镜下观：常规病理切片HE染色后，草酸钙结晶在偏光显微镜下显示为淡蓝色晶体，不规则，折光性较强；Von-kossa’s染色后，草酸钙晶体显示为黑褐色。A组大鼠肾组织结构紧密，可见正常的肾小体、近曲小管、远曲小管。B组大鼠肾组织中可见大量草酸钙结晶，主要存在于肾皮质、肾乳头、肾小管内；肾小体结构破坏，肾小球完全消失；肾小管管腔明显扩张，多数管腔内可见连接成片的草酸钙结晶；在高倍镜下观察可见肾小管上皮细胞肿大、变性、坏死，管腔内可见嗜伊红染色样坏死物质及部分脱落上皮细胞，肾间质可见慢性炎性细胞。C，D，E，F组大鼠肾组织中草酸钙结晶明显少于B组，肾组织结构破坏较B组轻。D，E，F组大鼠肾组织中草酸钙结晶仅少量存在于肾皮质，肾小体结构破坏少，肾小管管腔扩张轻，高倍镜下可见管腔内未有明显的坏死脱落物质，肾间质中慢性炎性细胞极为少见

本实验采用1%乙二醇（EG）饮水＋隔天灌胃0.5 μg/mL 1α-羟基维生素D31 mL[11]诱导大鼠肾草酸钙结石形成。乙二醇水溶性强，吸收后迅速分布于血液及组织液中，并很快在肝脏经乙醇脱水酶代谢为乙醇醛，再经乙醛脱水酶代谢为乙醇酸，乙醇酸经乙醇酸氧化酶氧化为乙醛酸，最后主要的代谢物为草酸；1α-羟基维生素D3可促进小肠黏膜上皮和肾小管上皮细胞对钙的吸收，促进骨钙的释放。长期应用可是大鼠的尿钙浓度升高，临床上许多结石患者对钙的吸收主要是通过对维生素D3依赖机制，故1α-羟基维生素D3是草酸钙结石形成的重要危险因素[12]。增加肠内的钙吸收，使血钙升高；草酸与钙结合形成草酸钙结晶在肾脏沉积，引起肾损伤，破坏肾功能。结晶长期沉积可堵塞肾小管，造成肾小管扩张，小管上皮细胞肿大、变性、坏死、脱落，脱落的细胞形成新的结石中心，进一步加重结石的沉积。本实验中，B组大鼠的血清BUN、Cr含量，24 h尿钙分泌量，肾钙含量显著高于A组，在肾组织病理切片中同样可以观察到B组大鼠肾组织中草酸钙结晶明显多于A组。从实验所测结果看，泽泻+车前子复方不同剂量组能明显降低草酸钙结石大鼠24 h尿钙分泌量，肾组织钙含量以及草酸钙晶体在肾组织内的沉积，一定程度上减轻了肾小管的扩张，从而达到保护肾脏的作用。枸橼酸钾是已应用于临床的有效预防结石的药物，研究表明枸橼酸是一种很强的钙离子螯合剂[13]，可降低钙离子活性、浓度及其饱和度，从而减少钙结晶的析出，阻断结石的成核、生长和聚集过程，也可碱化尿液，具有利尿作用[14]同时枸橼酸钾可通过封闭晶体生长点，改变晶体表面电荷或晶体几何形态，达到对草酸钙晶体生长和聚焦的抑制作用。在本实验中设为阳性对照组。从实验结果分析，泽泻+车前子复方不同剂量组能更好的减少草酸钙结石的形成，改善肾功能作用更加明显。

目前尚无学者对泽泻+车前子复方水提取液抑制草酸钙结晶进行研究，有必要对这两种传统利尿通淋的中药作进一步更深入的研究，以期能发挥传统中药更大的功效。

[1]吴阶平.吴阶平泌尿外科学[M].济南:山东科学技术出版社,2004.

[2]小川由英.尿路结石に对する汉方制剂の化学的解析に关しこ[J].汉方医,1985,9(9):119.

[3]尹春萍,刘继红,章咏裳,等.泽泻水提取液预防草酸钙结石形成的体外及动物实验研究[J].同济医科大学学报,1997,26(2):99.

[4]李浩勇,刘继红,曹正国,等.中药泽泻提取物对尿草酸钙结石形成影响的实验研究[J].中华泌尿外科杂志,2003,24(10):658-662.

[5]邵绍丰,张爱鸣,刘耀,等.单味中药金钱草、石韦、车前子对大鼠肾结石肾保护作用的实验研究[J].浙江中西医结合杂志,2009, 19(6):342.

[6]尚旭明,田华.1036例肾、输尿管结石成分分析[J].临床检验杂志,2007,25(2):159-160.

[7]栗田 孝.八竹 直,郡健二郎.づぃり猪苓汤の尿管结石排泄に及ねは效果检讨[J].泌尿纪要,1981,27:565-567.

[8]Utsumomiya M,koide T,Yamaguchi S,et al.The effect of kanpou medicine on the growth and aggregation of calcium oxalate crystals in vitro[J].Hinyokika Kiyo,1991,37(10):1097-1101

[9]Yamaguchi S,Jihong L,Utsunomiya M,et al.The effect of takusha and kagosou on calcium oxalate renal stones in rats[J].Hinyokika Kiyo,1995,41(6):427-431.

[10]尹春萍,刘继红,张长弓.不同离子强度及PH值泽泻和夏枯草对草酸钙结晶形成的抑制作用观察[J].同济医科大学学报,1996, 25(4):321-323.

[11]曹正国,刘继红,段永芳,等.几种实验性大鼠肾草酸钙结石模型的比较研究[J].华中科技大学学报,31(5):556-563.

[12]Nillson OS,Urist MR,Dawson EG.Bone repair induced by bone morphogenetic proeyein in ulnar defects in dogs[J].J Bone Joint Surg,1986,68(4):635

[13]Kok DJ.Physiochenical explantation for the role of citrate in recurrent store disease[J].Urol Res,1986,14:94.

[14]余志远,石洪波,张雷军,等.金桔液预防草酸钙肾结石的实验与临床研究[J].临床泌尿外科杂志,2005,20(9):543-545.

The Effect of Alisma and Plantago Compound on Experimental Urinary Calcium Oxalate Stones Formation in Rats

ZHAI Xin-yu, DING Yi, ZHAO Jian-hua
(Affiliated Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Objective To study the effect of alisma and plantago compound on experimental urinary calcium oxalate stone in rats and to confirm that it can inhibit the formation of calcium oxalate kidney stone and protect renal function. Methods Different alisma and plantago compound exteacts were administered through a stomach tube to rats of different groups with renal calcium oxalate stones induced by ethylene glycol(EG) and ammonium chloride(AC). Results The urolithiasis induced by thylene glycol(EG) and ammonium chloride(AC) could cause significant increase in the level of serum urea, serum creatinine, urine oxalate, urine Ca2+and renal Ca2+. The alisma and plantago compound reversed the changes in the levels of serum urea, serum creatinine, urine Ca2+and renal Ca2+. It also diminished the number and size of calcium oxalate crystal deposits and protected the kidneys from serious damage. Conclusion Alisma and Plantago compound can inhibit urinary calcium oxalate stone formation in rats and protect renal function.

Urinary stone; Calcium oxalate; Alisma; Plantago; Rat

R285.5

B

1671-8194（2016）31-0012-03