酶法制备南瓜籽壳纤维低聚糖

张珍林

(皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)



酶法制备南瓜籽壳纤维低聚糖

张珍林

(皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

以南瓜籽壳纤维为原料，采用酶法制备纤维低聚糖，并结合高效液相色谱法(HPLC)进行定量测定。结果表明：利用β-葡聚糖酶在酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h、酶用量4 U/g的情况下酶解，可以得到较高比例的葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，最终计算纤维低聚糖得率为12.2 g/100 g。

南瓜籽壳纤维；纤维低聚糖；β-葡聚糖酶

南瓜一种葫芦科植物的果实，具有全面而又丰富的营养；南瓜的种籽同样是国内外医药界公认的功能性食品[1]，这种功能性食物目前的利用形式往往都是取籽弃壳。查文献知道，正常状态下，壳占整个南瓜籽的重量的60%，假若某地一年产南瓜籽5万吨，那就相当于约3万吨的壳可能被遗弃，据医学研究报告，南瓜籽壳能作为某些特殊功能药剂的原料，使糖尿病患者和高血压患者有明显的医疗康复作用和缓解作用[2-4]，这块巨大的资源能尽快地开发和利用，不仅可以避免环境污染，又可以增加种植者的收益。

纤维低聚糖亦称纤维寡糖(cello-oligosaccharide)，文字描述指具有2～10个葡萄糖单体通过β-1,4糖苷键链接而成的线性低聚糖，具有一定功能性的低聚糖；这种寡糖能促进人和动物体肠道双歧杆菌增殖，利于肠道蠕动，同时肠道也不会吸收[5-7]。另外，由于纤维低聚糖带有甜味，甜度约为蔗糖的30%～40%，可以作为食品的甜味添加剂，代替蔗糖用于糖尿病患者的食品(如纤维二糖、纤维三糖)。β-1,4糖苷键的链接使得纤维低聚糖产生了如下的特性：结构刚性强、分子质量小、稳定性好等[8-10]，加大了应用范围，提高了应用前景。

现在测定纤维低聚糖的方法有很多，考虑本实验测定物料的要求，选用高效液相色谱法(HPLC)是最简单、最快速、最精确；运用HPLC法，以紫外检测器对南瓜籽壳粉中的纤维低聚糖组分进行测定。结合酶法制备纤维低聚糖，为南瓜籽壳纤维低聚糖的定向制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南瓜籽壳粉，自制；β-葡聚糖酶，武汉宏信康精细化工有限恭喜；葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖标准品，美国AccuStandard公司；氢氧化钠与乙酸钠为优级纯；其他药品及试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters Breeze高效液相色谱系统(配有可变波长紫外检测器和Rev.A.06.03色谱工作站)；HMBTO1型超微粉碎机；DZF-6050型真空干燥箱；UV-2102C型紫外-可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

选择外表光滑、无病虫害南瓜籽壳洗涤数次，去除杂质，80 ℃烘干后超微粉碎过220目筛备用。采用硝酸-乙醇法[11]测定南瓜籽壳粉的纤维素含量为 44.83%。

1.3.2 纤维低聚糖的制备

1.3.2.1 工艺流程

预处理的南瓜籽壳粉→一定浓度的南瓜籽壳粉悬浊液(加入pH 5.0 柠檬酸缓冲溶液)→酶解(β-葡聚糖酶)→灭酶(100 ℃ 12 min)→抽滤，滤液即为纤维低聚糖溶液。

1.3.2.2 单因素实验

选择对酶解南瓜籽壳粉纤维低聚糖影响较大的三个因素，酶解温度、酶解时间、酶用量，进行单因素实验。选取不同的单因素条件，酶解温度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)，酶解时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)和酶用量(3 U/g、4 U/g、5 U/g、6 U/g、7 U/g、8 U/g、9 U/g)，进行酶解，得到的酶解产物通过HPLC法定量显示，观察图谱发现不同的单因素条件下，纤维低聚糖各组分的质量浓度和比例都不一样，读取峰值带入公式，从而确定最佳的各单因素条件。

1.3.3 纤维低聚糖的HPLC检测

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：CarboPac 18-100分析柱(4.6 mm×250 mm)，检测器：紫外检测器，流动相：3.0 mmol/L 甲醇水溶液，柱温：40 ℃，进样量：10 μL，流速：0.8 mL/min。

1.3.3.2 标准溶液的配制及检测

精确称取1 mg葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖标准品，溶于10 mL去离子水中，配制成浓度为100 μg/mL的标准品溶液，冷藏保存待测。

1.3.3.3 南瓜籽壳粉样品检测

精确称取0.1 mg经过酶解的南瓜籽壳粉样液，用200 mL去离子水稀释，得到0.5 μg/mL的稀释样液，进样前需经0.45 μm水系滤膜过滤后，用微孔进样器注入仪器。

1.3.4 纤维低聚糖得率计算

纤维低聚糖得率/%=

×100

2 结果与分析

2.1 处理样品的酶制剂选择

样品南瓜籽壳粉经过一系列的前处理后，组分也就很简单，基本都是大分子的纤维素，由于纤维素酶的酶系复杂性，酶解时断开糖苷键比较凌乱，得到的酶解产物也不只是低聚糖，增加检测的复杂性，从根本出发考虑纤维素是由β-1,4-糖苷键连接一系列葡萄糖分子构成[12-14]，因此本实验决定利用β-葡聚糖酶进行酶解，结合HPLC的定量分析发现β-葡聚糖酶，能准确地切断链接葡萄糖的β-1,4糖苷键，简便有效地分解出纤维低聚糖的各组分，使得定量更加准确。

2.2 测纤维低聚糖的色谱条件

HPLC法测定含有极性基团的大分子时一般选用水作为流动相，实验过程发现，简单的水流动相不能很好分离纤维低聚糖各组分；通过使用混合流动相甲醇水溶液不仅可以使分离度提高，而且还可以明显降低分离时间，加入3.0 mmol/L 的甲醇效果最佳。考虑实验样品的本身性质，在进行流速设定时，分别为0.5 mL/min、0.8 mL/min、1 mL/min进行预实验，结果发现，流速为0.8 mL/min时，峰形保留时间恰当，分离效果最佳。

2.3 纤维低聚糖色谱分析

图1 标准品HPLC图(注：1纤维四糖；2纤维三糖；3纤维二糖；4葡萄糖)

图2 样品HPLC图(注：1纤维四糖；2纤维三糖；3纤维二糖；4葡萄糖)

标准品及南瓜籽壳粉样品图谱如图1和图2。通过分析样品测定图谱发现，在色谱图中通过与标准品单糖保留时间比较后判断该样品用β-葡聚糖酶可以酶解出葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，在样品图中除了和单糖图谱相对应的峰形，距离纤维四糖附近保留6 min处有一明显色谱峰，通过查资料初步判断可能是纤维五糖[15]。因此，对进一步分离南瓜籽壳粉中的纤维低聚糖组分提供了一定的基础。

2.4 标准回归方程

稀释标准品溶液按照10、20、40、60、80、100 μg/mL的梯度，经0.45 μm水系滤膜过滤后，用微量进样器分别进样分析，根据结果计算以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得标准曲线回归方程见表1。读取表1数据可以明显看出，四种糖的线性相关系数R2均大于0.99，这是四个线性特征非常明显的实验模型，可以作为定量的依据。

表1 标准回归方程

2.5 最佳酶解温度

观察图3发现，最佳的酶解温度应为50 ℃，在50 ℃之前，随着温度的升高，产物的质量浓度是逐渐增加，达到50 ℃葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的质量浓度最大，继续升温，产物的质量浓度又开始下降，说明温度升高影响了酶的活力，降低了酶的酶解质量。因此，本实验最佳的酶解温度为50 ℃，通过峰面积计算各组分所占比例，纤维二糖(31.8%)、葡萄糖(26.8%)、纤维三糖(9.45%)、纤维四糖(4.12%)。

图3 酶解温度对酶解南瓜籽壳粉纤维低聚糖的影响

2.6 最佳酶解时间

观察图4发现，最佳的酶解时间应为2.5 h，在2.5 h之前，酶解产物各组分的质量浓度都是增加状态，在2.5 h之后，聚合度小的葡萄糖、纤维二糖浓度继续增加，但很慢，聚合度稍大的纤维三糖、纤维四糖浓度则呈现下降的趋势。分析此原因主要是由于随着时间的增加β-葡聚糖酶也会随机切断聚合度稍大的纤维三糖和纤维四糖，成为聚合度小的纤维二糖和葡萄糖[16]。因此本实验最佳的酶解时间为2.5 h，通过峰面积计算各组分所占比例，纤维二糖(40.9%)、葡萄糖(32.3%)、纤维三糖(6.21%)、纤维四糖(3.33%)。

图4 酶解时间对酶解南瓜籽壳粉纤维低聚糖的影响

2.7 最佳酶用量

观察图5发现，最佳的酶用量应为4 U/g，在4 U/g之前，增加酶量，各组分质量浓度都是大幅度的增加状态，在4 U/g之后，葡萄糖和纤维二糖继续增加，纤维三糖稍有下降趋势，但纤维四糖的量却在5 U/g时达到最大，此后随着酶量的加大，纤维三糖和纤维四糖开始减少；分析是由于酶量的加大，体系中游离酶增加，一方面积极酶解大分子低聚糖，另一方面在反应中又进一步酶解了聚合度大的纤维三糖和纤维四糖。因此，综合考虑本实验最佳的酶用量4 U/g，通过峰面积计算各组分所占比例，纤维二糖(31.25%)、葡萄糖(22.8%)、纤维三糖(7.75%)、纤维四糖(4.23%)。

图5 酶用量对酶解南瓜籽壳粉纤维低聚糖的影响

3 结论

选用β-葡聚糖酶酶解，通过单因素确定了酶解温度、酶解时间、酶用量三个主要实验因素的取值范围，配合HPLC法定量分析，以CarboPac 18-100分析柱(4.6 mm×250 mm)，3.0 mmol/L甲醇水溶液流动相，0.8 mL/min流速检测南瓜籽壳粉中的纤维低聚糖，同时以标准品的外标法进一步确定了定量的准确性，线性相关系数R2>0.99，说明该实验模型很好。质量浓度的最大值确定了最佳酶解条件：酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h、酶用量4 U/g，在此最佳条件上计算纤维低聚糖为12.2 g/100 g。 实验结果显示此法简便、准确，为后续开发南瓜籽壳粉深加工食品提供了一定的基础资料。

通过HPLC样品图谱发现酶解产物中除了存在葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖外，还可能存在丰富的纤维五糖，但由于标准品的不具备，没有进一步进行认证实验，这样的一个实验结果也为继续研发南瓜籽壳的功能特性提供了依据。

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Preparation of Cello-oligosaccharides from Pumpkin Seeds Shell Fiber by Enzymatic Method

ZHANG Zhenlin

(CollegeofBiologicalandpharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China)

An enzymatic method for the preparation of cello-oligosaccharides from pumpkin seeds shell fiber was developed, and HPLC was used for quantitative determination. The results showed that the hydrolysis obtained after 50 ℃ of hydrolysis with 2.5 h of hydrolysis with 4 U/g β-glucanase contained a high proportion of glucose, cellobiose, cellotriose and cellotetrose, and the yield of cello-oligosaccharides was 12.2 g/100 g under these conditions.

pumpkin seeds shell fiber; cello-oligosaccharides; β-glucanase

2016-05-06

六安市定向委托皖西学院市级研究项目(2013LW020)。

张珍林(1985-)，女，安徽霍邱人，助教，硕士，研究方向：食品研究与开发。

TS241

A

1009-9735(2016)05-0075-04