雷帕霉素抑制人前列腺癌细胞PC－3生长及转移的实验研究

辛 华， 于海东， 杨志伟， 王 琳， 刘君星， 江清林

(佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154003)

雷帕霉素抑制人前列腺癌细胞PC－3生长及转移的实验研究

辛 华， 于海东， 杨志伟， 王 琳， 刘君星， 江清林

(佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154003)

目的:对人前列腺癌细胞PC－3进行雷帕霉素的药物试验，并观察其对细胞生长及转移的影响。方法:抽取2012年3月至2013年11月本院经体外培养的人前列腺癌细胞PC－3作为研究样本，分别采用0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的雷帕霉素对其进行药物干预，并采用MTT法以及流式细胞仪等检测措施分别观察PC－3细胞的增殖、周期以及凋亡等变化。结果:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生长增殖未受到任何抑制作用。分别在12h、24h以及36h的培养时间下，25ng/mL的雷帕霉素浓度具有更高的细胞生长抑制率，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，分别在两种不同的浓度下，12h、24h以及36h之间两两比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。分别在12h、24h以及36h的培养时间下不同浓度的雷帕霉素组间两两比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，分别在三种不同浓度下，对不同培养时间的组别进行比较，除了0ng/mL下24h与36h的培养时间下PC－3凋亡作用差异具有统计学意义(P＞0.05)，其他组间两两相比均具有统计学意义(P＜0.05)。结论:雷帕霉素对人前列腺癌细胞PC－3具有较好的抑制生长及转移效果，且浓度越高，培养时间越长，效果越明显。

雷帕霉素； 人前列腺癌细胞； PC－3； 转 移

本次实验主要通过对人前列腺癌细胞进行雷帕霉素的药物实验，观察其对癌细胞增殖生长以及侵袭转移的影响，具体如下。

1　资料与方法

1.1一般资料:抽取2012年3月至2013年11月本院经体外培养的人前列腺癌细胞PC－3作为研究样本。所有细胞样本均具有稳定的生长速度，选择IlyClone公司的RPMI－1640培养基对细胞进行培养，该培养基主要含有10%的胎牛血清、1%的链霉素以及1%的青霉素[1]。进而采用胰酶进行消化，传代培养，并取对数期生长的细胞进行实验。

1.2方 法

1.2.1药物浓度的设置:将雷帕霉素药物分别按照0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的三种不同浓度溶于培养液中进行培养，并将0mg/L的组为对照组。

1.2.2采用MTT法对PC－3细胞增殖生长的测定:取对数期生长的PC－3细胞，冲洗消化后，将其与96孔培养板内进行接种，1000个细胞每孔，并于孵箱中继续培养24h，保持5%的二氧化碳浓度以及37℃的箱温。之后，除去培养液，将三种不同浓度的雷帕霉素溶液分别加入每孔内，为保证实验的准确性，每个浓度的试验可在6个重复孔内进行，继续在温育下分别培养12h、24h以及36h。将5mg/mL的MTT分别加入每孔中，20μl每孔，继续培育4h，取出上清液，在将DMSO分别加入每孔中，150μl每孔。10min后常规进行PC－3细胞生长增殖抑制率的计算，依据公式:抑制率＝[(对照组OD值－本底OD值)－(实验组OD值－本底OD值)〛/(对照组OD值－本底OD值)]×100%[2]。

1.2.3流式细胞术FCM对PC－3细胞周期变化的检查:将PC－3细胞接种于细胞培养瓶(25cm2的容量)内，配置1×106/mL的细胞浓度，置于5%的二氧化碳浓度以及37℃的环境下进行培养，24h后除去培养液，再将其置于4℃的环境下培养，以保证细胞的同步化生长，2h后分别将不同浓度的2.5mL雷帕霉素溶液对应加入各瓶内，再次孵育12h、24h以及36h后，取出旧培养液，并采用磷酸盐缓冲液对培养瓶进行冲洗，常规消化处理，再将1.5mL的枸橼酸溶液加入其中，配置1 ×106/mL的悬液细胞，再次进行磷酸盐缓冲液的冲洗，之后对其进行5min的离心处理，取出细胞，并采用70%的乙醇进行固定。再次进行5min的离心处理，收集固定细胞，去除上清液。在避光环境下加入Binding Buffer，30min后再加入PI，5min后再次加入Binding Buffer，随后采用流式细胞仪进行细胞死亡率以及凋亡率的检测。

1.3观察指标:①观察不同浓度的雷帕霉素对人前列腺癌细胞增殖生长的抑制情况，并将12h、24h以及36h的不同培养时间下的抑制效果进行比较。②观察不同浓度的雷帕霉素对人前列腺癌细胞凋亡的影响，并将12h、24h以及36h的不同培养时间下的凋亡作用进行比较。

1.4统计学方法:采用SPSS19.0软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，计数资料以率表示，组间比较采用F检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结 果

2.1不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对PC－3生长增殖抑制的影响:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生长增殖未受到任何抑制作用。分别在12h、24h以及36h的培养时间下，25ng/mL的雷帕霉素浓度具有更高的细胞生长抑制率，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，随着雷帕霉素浓度的逐渐增高，PC－3的生长抑制效果越好。分别在两种不同的浓度下，12h、24h以及36h之间两两比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，培养时间越长，PC－3的增殖抑制效果更好。见表1。

表1　不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对细胞生长抑制率的影响(±s)

表1　不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对细胞生长抑制率的影响(±s)

注:F＞2时组间相比具有统计学意义(P＜0.05)

雷帕霉素浓度12h24h36hF 10ng/mL17.9±0.3ab28.1±1.1c32.0±0.52.584 25ng/mL24.8±1.2de34.5±1.3f43.2±0.92.610 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.2不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对PC－3细胞凋亡的影响:分别在12h、24h以及36h的培养时间下对不同浓度的雷帕霉素对PC－3细胞的凋亡作用进行观察，发现组间两两比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，随着浓度的不断升高，对PC－3细胞凋亡的作用越明显。同时分别在三种不同浓度下，对不同培养时间的组别进行比较，相关数据相比均具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对PC－3细胞凋亡的影响(±s)

表2　不同浓度雷帕霉素在不同培养时间下对PC－3细胞凋亡的影响(±s)

注:F＞2时组间相比具有统计学意义(P＜0.05)

雷帕霉素浓度12h24h36hF 0ng/mL3.8±0.2ab5.9±0.4c6.1±0.62.537 10ng/mL10.8±0.3de17.7±0.9f20.6±0.83.227 25ng/mL14.9±0.5gh21.3±1.0i28.5±1.23.970 F2.8212.0983.550 P＜0.05＜0.05＜0.05

3　讨 论

雷帕霉素属于一类新型的大环内酯类免疫抑制剂，可通过阻断不同细胞因子间的传导信号，破坏癌细胞的生长进程，从而起到较好的抑制生长及侵袭转移的作用[3]。本次试验通过细胞培养，探讨不同浓度的雷帕霉素对PC－3细胞的生长抑制及转移效果。0ng/ mL的雷帕霉素未对PC－3的生长增殖起到任何抑制作用，然而在不同的雷帕霉素浓度下，PC－3的生长抑制率各不相同，浓度越高，其抑制效果越好。然而不同的培养时间也对PC－3的生长抑制具有不同的效果，培养时间越长，其抑制率越高，如此次试验中分别在两种不同的浓度下，差异显著，说明培养时间越长，PC－3的增殖抑制效果更好。雷帕霉素对PC－3的凋亡作用于生长抑制作用形似，分别在12h、24h以及36h的培养时间下对不同浓度的雷帕霉素对PC－3细胞的凋亡作用进行观察，浓度越高，PC－3凋亡作用越强。同时，分别在三种不同浓度下，对不同培养时间的组别进行比较，均表现为培养时间越长，PC－3凋亡作用越显著。

[1] 边跃俊.前列腺特异抗原(PSA)检测的临床应用[J].哈尔滨医药，2005，25(6):94～96.

[2] 韩娇艳.盐酸川芎嗪通过mTOR信号通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC－3细胞的增殖[D].重庆医科大学，2013.

[3] 姚双，康晓明，李丽，等.雷帕霉素对大鼠慢性肾间质纤维化中HGF、TGF－β的表达的影响[J].黑龙江医药科学，2013，36(3):11～12.

1006－6233(2016)11－1891－02

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.059

黑龙江省自然科学基金项目，(编号:D201225)；佳木斯大学科学技术重点项目，(编号:12Z1201504)

江清林，E－mail:jqljms＠126.com