钙激活氯通道TMEM16A在大鼠心房和心室中的表达差异

张爱梅，姜晓霞，陈 鑫，官晓筠，万慧娟，李 丽，马克涛，司军强



·论著·

钙激活氯通道TMEM16A在大鼠心房和心室中的表达差异

张爱梅，姜晓霞，陈 鑫，官晓筠，万慧娟，李 丽，马克涛，司军强

目的 探究钙激活氯通道(CaCCs)TMEM16A在大鼠心房和心室组织中的表达情况，为临床治疗心肌缺血、心律失常以及心力衰竭等疾病提供新的治疗靶点。方法 2014年10月—2015年9月，将18只清洁级Sprague-Dawley大鼠适应性饲养1周，采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后取心脏，分离心房和心室组织进行实验。采用Western blotting法和实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)法分别检测大鼠心房和心室组织中TMEM16A及其mRNA水平。结果 大鼠心房和心室组织TMEM16A水平分别为(0.46±0.02)和(0.33±0.03)，心房和心室组织TMEM16A mRNA水平分别为(3.55±0.17)和(1.00±0.03)，大鼠心房组织中TMEM16A及其mRNA水平高于心室组织(P<0.01)。结论 CaCCs TMEM16A在大鼠心房和心室组织中均有表达，其在心房组织中的水平高于心室组织。

TMEM16A；钙激活氯通道；心房；心室

张爱梅，姜晓霞，陈鑫，等.钙激活氯通道TMEM16A在大鼠心房和心室中的表达差异[J].中国全科医学，2016，19(36)：4495-4498.[www.chinagp.net]

ZHANG A M,JIANG X X,CHEN X,et al.Differences in the expression of calcium-activated chloride channels TMEM16A in rat atria and ventricles[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4495-4498.

钙激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一类具有重要生理功能的离子通道，参与调节上皮细胞分泌、感觉传导、神经元和心肌细胞兴奋性以及血管舒缩活动等多种生理过程[1]。尽管CaCCs在生理、病理中均发挥重要作用，但由于其缺乏特异性阻断剂，使得无法对其分子机制进行更深入的研究。TMEM16A广泛表达于多种细胞上，其介导的钙激活氯电流〔calcium-activated chloride currents,ICl(Ca)〕具有典型的Ca2+浓度依赖性和电压依赖性，当Ca2+浓度较低时，其表现出明显的外向整流特性；当Ca2+浓度较高时，没有整流特性，I-V曲线呈线性。TMEM16A介导的ICl(Ca)的生物物理特征与经典的ICl(Ca)相似，因此，TMEM16A被认为是CaCCs蛋白基础[2-4]。随后的研究表明在腺泡细胞、内皮细胞、Cajal间质细胞以及平滑肌细胞均能检测到TMEM16A的表达，并且作为CaCCs的分子基础，发挥重要作用[5]。

目前关于TMEM16A在心脏组织的表达与分布以及如何参与调节心肌组织正常生理过程及病理活动的报道较少，本研究旨在初步探讨TMEM16A在正常大鼠心房和心室组织的表达与分布，为进一步研究CaCCs在心脏中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Sprague-Dawley大鼠18只，8～10周龄，雌雄不限，体质量200～250 g(新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物饲养科提供)，许可证编号SCXK新2003-0001。

1.2 主要试剂与仪器 Trizol(美国Life-invitrogen公司)，反转录试剂盒(美国Thermo Scientific Fermentas公司)，QuantiFastTMSYBR®Green PCR(德国Qiagen公司)，TMEM16A上下游引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，RIPA裂解液(北京索来宝科技有限公司)，兔多克隆TMEM16A抗体(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗及β-actin一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)和Western blotting操作中全套设备均来自Bio-Rad公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 心房和心室组织的取材与分离 2014年10月—2015年9月，将18只清洁级Sprague-Dawley大鼠适应性饲养1周后，采用10%水合氯醛溶液0.3 mg/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔，暴露心脏，迅速取下完整心脏，置于PBS中反复冲洗，待将残留的血液清洗干净后，剪去与心房和心室相连的动静脉以及附着于其上的各种筋膜组织，充分暴露洁净的心房、心室组织后，沿房室沟将心房与心室分离，并置于液氮中保存备用。

1.3.2 Western blotting法检测TMEM16A水平 取分离好的心房、心室组织各100 mg，采用RIPA裂解液按试剂盒说明提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为40 μg/孔,β-actin作为内参照蛋白。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜(湿转100 V，2 h)，用5%脱脂牛奶、TBST封闭2 h。加兔抗鼠多克隆抗体TMEM16A(1∶200)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜(5 min×3次)，加HRP标记山羊抗兔二抗(1∶20 000)室温震摇孵育2 h，洗膜后(5 min×3次)加ECL显色曝光。将胶片扫描后用Image J图像分析软件进行各条带灰度值测定，与相应内参β-actin的灰度值相比得出蛋白的相对表达量，即TMEM16A水平。实验独立重复6次。

1.3.3 RT-qPCR法检测TMEM16A mRNA水平 取分离好的心房、心室组织各100 mg，以Trizol试剂提取总RNA。经Nanodrop分光光度计检测RNA的浓度与纯度。参照Fermentas反转录试剂盒操作要求反转录合成cDNA。依据QuantiFastTMSYBR®Green PCR试剂盒说明书配置25 μl反应体系，使用ABI7300实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃变性10 s,57 ℃退火30 s,40个循环；每次循环后收集荧光信号生成扩增曲线，反应结束后生成溶解曲线。采用2-ΔΔCt法计算TMEM16A mRNA水平。实验独立重复6次。目的基因为TMEM16A，管家基因为β-actin，引物序列见表1。

表1 引物序列表

2 结果

2.1 大鼠心房和心室组织TMEM16A水平比较 大鼠心房和心室组织TMEM16A水平分别为(0.46±0.02)和(0.33±0.03)，大鼠心房组织TMEM16A水平高于心室组织，差异有统计学意义(t=3.834，P<0.01，见图1)。

图1 大鼠心房和心室组织TMEM16A水平的电泳图

Figure1ExpressionofTMEM16Aproteininratatrialandventriculartissueshowninanelectrophorogram

2.2 大鼠心房和心室组织TMEM16A mRNA水平比较 大鼠心房和心室组织TMEM16A mRNA水平分别为(3.55±0.17)和(1.00±0.03)，大鼠心房组织TMEM16A mRNA水平高于心室组织，差异有统计学意义(t=-21.473，P<0.01)。

3 讨论

CaCCs是心脏中最主要的氯通道之一，与心肌组织各种电生理学活动密切相关[6]。生理状态下参与心肌细胞动作电位的早期复极过程，而CaCCs的异常活动可导致心律失常[7-8]。既往研究表明，在多种哺乳动物的心房、心室组织中均检测出CaCCs介导的ICl(Ca)[9]。在正常的心脏组织中，由于静息状态下细胞内钙离子(intracellular Ca2+，[Ca2+]i)浓度低，ICl(Ca)对舒张期膜电位和动作电位时程(action potential duration，APD)没有影响，当[Ca2+]i浓度持续增加超过生理水平时，CaCCs产生显著的瞬时外向电流，随着[Ca2+]i浓度时间进程逐渐衰减，ICl(Ca)能引起动作电位1期的早期去极化，从而缩短APD。当心肌组织出现Ca2+超载时，CaCCs介导的ICl(Ca)能够产生致心律失常的瞬时内向电流(inward current，ITI)。ITI能够诱导延迟后除极(delayed after depolarization，DAD)的发生，这是诱导激发异常电活动的重要机制。但也有学者认为这种引起动作电位1期的早期去极化的瞬时外向电流不是ICl(Ca)，而是钙激活的钾电流(Ca2+-activated K+currents)[10]。总之，由于多数情况下CaCCs介导的氯离子电流常和其他钙依赖性阳离子电流及非钙依赖性氯离子电流同时存在，这使得迄今对其在相关生理过程中所起的具体作用仍然知之甚少。

TMEM16A作为CaCCs的分子基础，成为近年来的研究热点。研究表明TMEM16A在机体的各种组织中被广泛表达，在人和其他动物的心脏、肺、肝脏、骨骼肌等部位均检测到TMEM16A mRNA[11]，并参与调节机体的生理、病理过程，如伤害感受、上皮细胞分泌、神经元信号转导、平滑肌收缩、宿主防御、细胞增殖等[12-13]。

TMEM16A与心血管系统的关系密切，该通道蛋白广泛分布于人类和其他哺乳动物各级动脉中，在胸主动脉、颈动脉及脑动脉中均发现了TMEM16A的表达，随后通过对不同部位的血管平滑肌细胞上的TMEM16A表达水平进行测定比较，发现其表达水平亦存在差异[14]。有研究表明，TMEM16A在大动脉的血管平滑肌细胞上表达水平较高，在中动脉血管及较大的小动脉平滑肌细胞上(如肠系膜动脉分支)低表达或不表达，其介导的ICl(Ca)很小甚至消失，但在小动脉的间质细胞及周细胞上TMEM16A的表达水平很高，其介导的ICl(Ca)也异常增大[15]。另有研究显示TMEM16A表达下调可以降低血管外周阻力，从而降低高血压的发生率[16]。最新研究显示，在小鼠左心室组织和左心室心肌细胞上均检测到了TMEM16A的表达[17]。随后在心脏血管内皮细胞上发现TMEM16A介导的ICl(Ca)激活与进入细胞内的钙离子浓度呈正相关[18]，这一点与CaCCs介导的ICl(Ca)动力学特性一致[19]。本研究发现TMEM16A在大鼠心室组织上亦有表达，且大鼠心房组织中TMEM16A及其mRNA水平均高于心室组织，这与GILES等[20]对兔心房、心室组织的研究得出的经典的ICl(Ca)在心房中比心室中大的结论相一致，推测这种表达差异可能与心房肌细胞和心室肌细胞本身在心脏组织中的电生理活动及其产生机制不同有关。

综上所述，大鼠心房组织CaCCs TMEM16A及其mRNA水平较心室组织高，这为进一步研究TMEM16A激活后的信号转导以及TMEM16A在心脏电生理活动的发生机制奠定了基础，并为临床治疗心肌缺血、心律失常以及心力衰竭等疾病提供了新的治疗靶点。

作者贡献：张爱梅进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；姜晓霞、陈鑫、官晓筠、万慧娟、李丽、马克涛进行实验实施、评估、资料收集；司军强进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

本研究不足之处：

未将心房组织和心室组织做进一步的分组，无法判断左右心房、左右心室之间TMEM16A是否存在表达差异。

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(本文编辑：毛亚敏)

Differences in the Expression of Calcium-activated Chloride Channels TMEM16A in Rat Atria and Ventricles

ZHANG Ai-mei,JIANG Xiao-xia,CHEN Xin,GUAN Xiao-jun,WAN Hui-juan,LI Li,MA Ke-tao,SI Jun-qiang.

Department of Physiology,Shihezi University School of Medicine；Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education;the First Affiliated Hospital of the Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China

SI Jun-qiang,Department of Physiology,Shihezi University School of Medicine；Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education,Shihezi 832002,China；E-mail:sijunqiang@shzu.edu.cn

Objective To explore the expression of calcium activated chloride channel (CaCCs) TMEM16A in rat atrial and ventricular tissues,so as to provide a new therapeutic target for clinical treatment of myocardial ischemia,arrhythmia and heart failure.Methods From October 2014 to September 2015，18 clean grade Sprague-Dawley rats were given 1 week of adaptive feeding,then,the heart was taken out after intraperitoneal injection of 10% chloral hydrate,and the atrial and ventricular tissues were isolated.The expression of TMEM16A and its mRNA in atrial and ventricular tissues were detected by Western blotting methods and real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR),respectively.Results The expression levels of TMEM16A in the rat atrial tissues were higher than those in the ventricular tissues〔(0.46±0.02) vs. (0.33±0.03),P<0.01〕.The expression levels of TMEM16A mRNA in the rat atrial tissues were higher than those in the ventricular tissues〔(3.55±0.17) vs. (1.00±0.03),P<0.01〕.Conclusion TMEM16A CaCCs was expressed in both atrial and ventricular tissues of rats,and the expression level in the atrial tissue was higher than that in the ventricular tissue.

TMEM16A；Calcium-activated chloride channels； Heart atrial ；Heart ventricles

国家重点基础研究发展计划项目(973计划项目)(2012CB26600)

832002新疆石河子市，石河子大学医学院生理学教研室 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室(张爱梅，万慧娟，李丽，马克涛，司军强)；石河子大学医学院第一附属医院(张爱梅，姜晓霞，陈鑫，官晓筠)

司军强，832002新疆石河子市，石河子大学医学院生理学教研室 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室；

E-mail:sijunqiang@shzu.edu.cn

R 331

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.018

2016-05-06；

2016-10-26)