Ⅰ期非小细胞肺癌病灶中nm23的表达及淋巴结微转移研究

周 霖，薛兴阳

作者单位： 518106 广东 深圳，深圳市光明新区人民医院 普外科(周 霖)；510095 广东 广州，广州医科大学附属肿瘤医院 胸外科(薛兴阳)



临床与基础研究

Ⅰ期非小细胞肺癌病灶中nm23的表达及淋巴结微转移研究

周 霖，薛兴阳

作者单位： 518106 广东 深圳，深圳市光明新区人民医院 普外科(周 霖)；510095 广东 广州，广州医科大学附属肿瘤医院 胸外科(薛兴阳)

目的 探讨Ⅰ期非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)病灶中nm23的表达及淋巴结微转移情况，以便为临床诊治提供参考。方法 选取2005年1月至2010年12月期间深圳市光明新区人民医院接诊的经根治性切除治疗的Ⅰ期NSCLC患者30例进行研究，检测原发癌灶石蜡标本中的nm23基因表达水平，并对常规病理检查为阴性的淋巴结以CK为标志物实施微转移检测。两种测定方式均采用免疫组化法，分析测定结果。结果 30例患者nm23阳性表达率为56.67%，阴性表达率为43.33%；常规病理检出阴性淋巴结132枚中有7例(20枚)检出淋巴结微转移，阳性率分别为23.33%、15.15%；nm23阳性组淋巴结微转移率明显低于阴性组(P<0.05)。结论 Ⅰ期NSCLC病灶中nm23表达与淋巴结微转移有相关性，联合检测对病理分期、预后评估等意义重大。

非小细胞肺癌； nm23表达； 淋巴结微转移； 肿瘤标记物

根据《2012年肿瘤登记年报》统计数据显示：肺癌已代替肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因。目前，我国每4例恶性肿瘤死亡者中就有1例是肺癌[1]。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)相比小细胞肺癌而言其癌细胞分裂更慢，扩散转移也更晚，约占肺癌的80%，且75%的患者确诊时已为中晚期，导致最佳治疗时机丧失，5年生存率普遍不高[2]。为此，加强NSCLC的早期诊断与治疗就显得十分关键，而了解其病灶中nm23表达与淋巴结微转移情况，对临床诊治有积极的意义。为进一步探讨Ⅰ期NSCLC病灶中nm23的表达及淋巴结微转移情况，我们实施了本研究，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究共计入选对象30例，全部为深圳市光明新区人民医院接诊的经根治性切除治疗的Ⅰ期NSCLC患者，入选时间为2005年1月至2010年12月。入选病例均有完整临床资料，术前均未接受任何抗肿瘤治疗，术后确诊符合Ⅰ期NSCLC诊断标准。30例中男24例，女6例；年龄26～71岁，年龄均值(59.7±2.6)岁；腺癌9例，鳞癌21例；高分化癌10例，中低分化癌20例；TNM分期显示10例为Ⅰa期，20例为Ⅰb期。

1.2 方法

1.2.1 试剂 CK角蛋白抗体、阴性部位胞浆(6 ml)、nm23单克隆抗体及阳性部位胞浆(6 ml)等。

1.2.2 样本 收集30例患者的原发癌灶标本与手术摘除的132枚淋巴结标本，两种标本均经甲醛固定与石蜡包埋保存待检。经常规病理检查证实为阴性的淋巴结石蜡标本中的每个淋巴结制作成石蜡切片(3 μm)，而经病理证实为Ⅰ期NSCLC的石蜡标本中的每个肺癌组织同样制作成石蜡切片(3 μm)。

1.2.3 nm23表达与淋巴结微转移测定 nm23蛋白表达测定与淋巴结微转移测定均采取免疫组化法处理。具体的方法与步骤如下：(1)于烤箱中置入石蜡切片，56 ℃，过夜。(2)二甲苯与梯度酒精脱蜡至水。(3)于pH=6的柠檬酸盐抗原修复液中置入切片，以高压锅法对抗原进行10 min修复，待其自然冷却后进行3次PBS冲洗。(4)利用双氧水(3%)处理10 min，以便灭活其内源性过氧化物酶，然后进行3次PBS冲洗。(5)利用山羊血清(5%)封闭15 min。(6)分别将鼠抗人细胞角蛋白单抗、nm23单克隆抗体及VEGF单克隆抗体加入，于室温下孵育1 h，然后进行3次PBS冲洗。(7)将生物素标记的二抗滴入其中，于室温下进行20 min孵育，然后进行3次PBS冲洗。(8)酶标记链霉菌生物素-过氧化物酶溶液10 min，然后进行3次PBS冲洗。(9)在室温下进行5 min DAN显色后苏木素复染，用酒精脱水后待二甲苯透明，利用中性树胶进行封片。

1.2.4 对照设定 设定阴性与炎性对照，大多数步骤与方法同前，而鼠抗人细胞角蛋白单抗、nm23单克隆抗体及VEGF单克隆抗体等以PBS代替，将已知阳性表达肺癌组织作为阳性对照。

1.2.5 判定方法 免疫组化法结果至少由2名医师参与判定，存有争议则进一步会诊判定。判定标准：(1)淋巴结细胞角质蛋白染色阳性判定标准为细胞膜与细胞浆中有棕黄色显色，而切片中见到角质蛋白染色阳性则视为淋巴结阳性微转移；(2)nm23和VEGF染色阳性判定标准为细胞浆中有棕黄色显色，若阳性细胞数超过10%则判定为阳性病例[3]。

1.3 统计学处理

本研究相关数据全部录入EXCEL表格中，便于回顾性分析，其中计数资料用%表示，利用统计学软件SPSS18.0处理，计数资料行χ2检验，P<0.05则差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌灶中nm23基因表达结果

经测定后显示，30例患者病灶中nm23基因表达阳性的有17例，阳性率为56.67%，13例为阴性表达，阴性率为43.33%。通过对比Ⅰa期与Ⅰb期病例的nm23基因表达可知，Ⅰa期nm23基因表达阳性率为50.00%(5/10)，Ⅰb期为60.00%(12/20)，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 淋巴结微转移测定结果

30例132枚淋巴结常规病理检查均显示为阴性淋巴结，其中有7例(20枚)检出有淋巴结微转移，微转移患者检出率为23.33%(7/30)，而淋巴结微转移检出率为15.15%(20/132)。

2.3 淋巴结微转移与一般资料、病理特征及nm23表达的关系

性别、年龄、病灶部位、病灶大小、病理类型等一般资料以及病理特征与淋巴结微转移无明显关系，但nm23表达阳性组与阴性组检出淋巴结微转移有明显差异(P<0.05)(表1)。

表1 有淋巴结微转移与无淋巴结微转移患者临床资料的比较

2.4 随访5年生存率情况

30例Ⅰ期NSCLC患者病灶中nm23基因表达阳性的17例中有12例完成了5年随访，其余5例随访2～3年后失访，完成5年随访者中有6例死亡，存活率为50.00%(6/12)；13例nm23基因表达阴性中有8例完成了5年随访，其余3例随访1～3年后失访，完成5年随访者中有1例死亡，存活率为87.50%(7/8)。经统计学分析可知，nm23基因阳性表达者的5年生存率显著低于阴性表达者(P<0.05)。

3 讨论

浸润转移属于肺癌恶性标志与特征，也是造成肺癌患者治疗失败与死亡最为主要的原因[4-5]，且根治术治疗后的Ⅰ期NSCLC患者5年生存率仍不足60%[6]。肿瘤转移是多因素与多基因共同作用的结果。近几年研究显示，nm23基因在调控肿瘤转移中起到了主要作用，尤其是其众多转移抑制基因，其编码产物核苷酸二磷酸激酶和肿瘤转移抑制、凋亡、分化及增殖等有关[7-8]。它主要有如下2个功能发挥作用：(1)nm23基因产物和微管聚合、ATP及G蛋白介导信号的传导功能有关，若基因发生变化，则产物发生改变，导致微管聚合，纺锤丝出现异常，生成非整倍体，使得癌细胞演进，并通过细胞骨架改变细胞因子等信号反应，从而促使细胞运动，达到侵袭与转移的目的[9]。(2)nm23蛋白有转录与调节作用，其氨基酸序列和转录因子有如亮氨酸拉链结构，能促进蛋白质形成二聚体，利用碱性氨基酸延伸，结合DNA，从而对转录调节产生影响[10]。此外，角蛋白(CK)可作为淋巴结微转移测定的指标，因为其存于细胞浆中，且能参与细胞结构与运动等作用，在上皮细胞中存在广泛，而淋巴结、骨髓等间叶组织中则缺乏表达[11]。NSCLC起源于上皮组织，保留上皮组织特性，鳞癌与腺癌中均有CK5、6、8、14等蛋白强表达，在常规病理检查阴性的淋巴结中若能检测出CK便可确认有微转移发生，因此本研究将其作为标记物进行淋巴结微转移的测定。

本研究采取免疫组化法测定原发癌灶切除后制作的石蜡标本的nm23基因表达水平与淋巴结微转移情况，结果显示，30例Ⅰ期NSCLC病灶nm23阳性表达率为56.67%，其中Ⅰa期的nm23表达阳性率稍高于Ⅰb期,但并无明显差异(P>0.05)；常规病理检出阴性淋巴结132枚，有7例(20枚)检出淋巴结微转移，检出率与阳性率分别为23.33%、15.15%；但在性别、年龄、病灶大小、病理类型等方面淋巴结阳性组与阴性组均无明显差异(P>0.05)；通过对nm23表达阳性者与阴性者进行5年随访可知，阳性者生存率显著低于阴性者(P<0.05)。此外，原发癌灶nm23基因高表达者淋巴结微转移检出率要显著低于阴性表达者，可见原发癌灶nm23表达和淋巴结微转移呈负相关。在同类研究中，如王武明等[12]针对40例根治性切除Ⅰ期NSCLC患者的原发癌灶石蜡标本以免疫组化法检测nm23表达及淋巴结微转移情况也有相似结果。可见Ⅰ期NSCLC原发癌灶中nm23基因的负调控机制在转移早期便已存在，若有单个或少数肿瘤转移时，nm23调控便发生，对肿瘤转移起抑制作用。

综上所述，Ⅰ期NSCLC病灶中nm23表达与淋巴结微转移有相关性，联合检测对病理分期、预后评估等有意义。

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XUEXingyang,E-mail：335046218@qq.com

Objective To investigate stage Ⅰ non-small cell lung cancer (NSCLC) expression and lymph node micrometastasis lesions nm23 in order to provide reference for clinical diagnosis and treatment.Methods 30 cases of stage Ⅰ NSCLC patients were studied after receiving radical resection, where after primary tumor resection as paraffin determination nm23 gene protein level, whereas the conventional pathological examination was negative lymph nodes (in CK is a marker) the implementation of micrometastases detected two ways were measured by immunohistochemical methods, measurement results were summarized.Results 30 cases of stage Ⅰ NSCLC Patients with nm23 positive rate was 56.67%, negative rate was 43.33%; routine pathological detection of lymph node negative was 132, 7 cases (20) the detection of lymph node micrometastasis detection rate and positive rate respectively, 23.33%, 15.15%; nm23 positive lymph node micrometastasis was significantly lower than the negative group (P<0.05). Conclusions StageⅠ NSCLC lesions of nm23 and lymph node micrometastases correlated, combined detection of pathological staging, prognostic assessment is of great significance, importance should be strengthened.

Non-small cell lung cancer; nm23 expression; Lymph node micrometastases； Tumor maker

周 霖，男，本科，E-mail：1010395656@qq.com

薛兴阳，男，博士.E-mail：335046218@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.04.010

1674-4136(2016)04-0254-04

2016-02-27][本文编辑：钦 嫣]

Stage Ⅰ non-small cell lung cancer and lymph node micrometastases expression of nm23ZHOULin1,XUEXingyang2.(1.DepartmentofGeneralSugery,ShenzhenGuangmingNewDistrictPeople’sHospital,Shenzhen518106,China；2.DepartmentofBreastSurgery,CancerHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095,China)