运动训练对2型糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65和相关蛋白表达的影响及机制研究

朱洪竹,阮晓娟,朱梅菊,曾志刚,肖国强



运动训练对2型糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65和相关蛋白表达的影响及机制研究

朱洪竹1,阮晓娟1,朱梅菊1,曾志刚1,肖国强2

目的：研究运动训练对2型糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65及相关蛋白表达的影响，以探讨运动改善2型糖尿病大鼠肾损伤的可能作用机制。方法：SD大鼠通过高脂饲料喂养6周和低剂量腹腔注射STZ的方法复制2型糖尿病大鼠实验模型。实验分为正常对照组(A)，糖尿病安静组(B)和糖尿病运动组(C)。C组进行6周的有氧游泳训练，其余两组不施加干预。实验结束后，测试随机血糖、24 h UAE、T-SOD、MDA、NF-κB-p65、Activated Caspase-3和Nephrin蛋白表达，并进行电镜观察肾脏显微结构的改变。结果：1)电镜下，运动干预的C组大鼠可见滤过膜3层结构较清晰，基底膜未见明显增加，足突稍肿大、足细胞融合等症状较B组大鼠均有所改善。2)运动干预后，C组大鼠的血糖浓度、24 h UAE排泄量均降低，与B组比较，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。3)运动干预后，C组大鼠肾皮质T-SOD活性上升而MDA含量下降，与B组比较，亦有明显差异(P<0.05或P<0.01)。4) 运动干预后，C组大鼠肾皮质NF-κB-p65和Activated Caspase-3蛋白表达均明显降低，而Nephrin蛋白表达明显增加，与B组比较，差异均呈显著性(P<0.05或P<0.01)。结论：运动能降低2型糖尿病大鼠血糖，减轻肾脏病理损伤，并提高肾功能,其机制可能与运动的下调氧化应激介导的2型糖尿病大鼠肾脏核转录因子NF-κB-p65的表达，以改善效应蛋白Activated Caspase-3异常表达和恢复足细胞特异标志物-Nephrin蛋白的表达，而改善大鼠肾脏损伤的保护作用有关。

2型糖尿病；运动训练；肾脏损伤；NF-κB-p65；相关蛋白；大鼠

前言

目前认为，2型糖尿病肾病变的临床早期主要表现为微量蛋白尿的出现且持续增加[2]。引起蛋白尿出现的根本原因是足细胞裂孔膜(Slit Diaphragm,SD)相关蛋白的损害或表达下调而导致的足细胞结构和功能的障碍[9,10]。Nephrin蛋白是足细胞表面的功能蛋白之一，由足细胞合成，其分布和表达的缺失可引起SD和足细胞形态的改变，进而出现蛋白尿[8,9]，引起肾小球损伤。研究已知，NF-κB是氧应激敏感的转录因子。高糖环境下，体内的氧化应激可激活NF-κB[21]，NF-κB异常活化可启动下游基因的转录，最终导致细胞凋亡，引起肾脏损伤[22]。但NF-κB介导的肾脏损伤，可否通过诱导活化凋亡蛋白Activated Caspase-3的表达增加来减少足细胞功能蛋白Nephrin的表达而影响足细胞功能，目前对此的直接报道较少。研究又发现，有氧游泳运动可降低2型糖尿病大鼠蛋白尿的排泄，保护受损肾脏[18]。目前尚不清楚运动的肾保护作用是否依赖其对NF-κB的调节，降低Activated Caspase-3的蛋白水平和恢复足细胞Nephrin的表达，来改善2型糖尿病大鼠肾脏损伤。

本研究采用高脂饮食饲喂6周+低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法诱导建立2型糖尿病大鼠实验模型，通过检测大鼠血糖、氧化应激水平、肾功能、NF-κB-p65、Activated Caspase-3和Nephrin蛋白的表达，观察有氧游泳运动对2型糖尿病大鼠早期肾脏损伤的影响，探讨运动的新的肾保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物造模与分组

模型的建立参照Reed等[17]研究方法进行改良。SPF雄性SD大鼠46只(购自中国科学院上海实验动物中心湖南斯莱克景达实验动物公司)，4周龄，体质量140±20 g。1周的适应性喂养后，随机分为正常对照组(A组，10只)和建模组(36只)2组。正常组继续饲喂普通饲料，建模组改为高脂饲料喂养，高脂饲料为普通饲料63.5%、蔗糖20%、猪油10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、胆酸盐0.5%。6周后，建模组行葡萄糖耐量试验和胰岛素敏感性实验后，确定存在胰岛素抵抗的建模大鼠经单次腹腔注射STZ(35 mg/kg bw)[17]，以复制2型糖尿病大鼠实验模型。注射STZ 1周后尾静脉采血测试血糖，以随机血糖≥16.7 mmol/L入选暂成模大鼠。连续观察1周后，再测血糖，随机血糖仍≥16.7 mmol/L确立为2型糖尿病建模成功。共29只大鼠符合2型糖尿病模型标准，随机分为糖尿病安静组(B组，14只)和糖尿病运动组(C组，15只)。

1.2 动物训练方案

动物运动方案参照Ploug等[16]的研究方法结合预实验经验，C组大鼠施加6周无负重游泳训练。第1～2周的训练时间分别是30 min/天和45 min/天，从第3～6周以60 min/天进行训练。每周训练6天，中间休息1天。水温保持在33±1℃,水深50 cm。

1.3 主要试剂

免抗鼠NF-κB-p65、Activated Caspase-3、Nephrin均为多克隆抗体，购于北京博奥森生物公司；大鼠尿微量白蛋白(UAE)ELISA Kit购自美国ABR公司；总超氧化物岐化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)测试盒均购于南京建成生物公司。

1.4 实验取材与指标检测

1.4.1 实验取材

6周游泳运动干预停止36 h后，过夜禁食12 h，大鼠分批麻醉处死。麻醉前1天代谢笼收集24 h尿液，测24 h尿微量白蛋白(24 h UAE)。大鼠腹腔麻醉，心脏采血，经左心室插管冷生理盐水充分灌洗肾脏，分离肾皮质，入-20℃冰箱保存待测SOD活性和MDA含量。另分离新鲜肾皮质，入多聚甲醛固定溶液(4%)中固定，待作免疫组化检测。取肾脏髓质交界处皮质部分，一半切取1 mm3肾皮质组织放入2.5%戊二醛电镜固定液中，用于制备电镜标本；另一半放入液氮中速冻后转移到-80℃超低温冰箱保存待用免疫印迹法检测Activated Caspase-3和Nephrin蛋白表达量。

1.4.2 指标检测

1.肾脏电镜标本的制作与观察。1 mm3的肾皮质组织块固定4 h后，经1%锇酸固定、常规梯度脱水、渗透、包埋与聚合、切片(厚度约80 nm)、饱和醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。美国透射电镜(Tecnai G2 S-Twin)与Digital Microgragh摄像软件主要观察肾小球滤过屏障(毛细血管基底膜、内皮细胞、足细胞)超微结构。

2.血糖和24 h UAE测定。血糖的测定采用生化法；24 h UAE的测定采用酶联免疫法(ELISA法)。

3.肾皮质SOD、MDA指标的检测。采用常规生化法检测，严格按试剂盒操作说明书进行。

4.NF-κB-p65 免疫组织化学检测。 常规方法制作肾皮质石蜡切片(厚度3 μm)，NF-κB-p65的表达采用Envision免疫组织化学染色。严格按试剂盒的说明书操作(NF-κB-p65一抗工作浓度为1∶500)。用OLYMPUS公司的BX41型光学显微镜观察，图像分析系统(Image-Pro Plus生物医学图像分析软件)检测阳性表达。测定NF-κB-p65的IOD值和AREA，计算MOD，即MOD=IOD值/AREA，其值越大表示NF-κB-p65阳性产物表达越强。

5.Activated Caspase-3、Nephrin指标Western-blotting检测。检测步骤为：样品聚丙烯酰氨凝胶电泳后，将胶上蛋白转移至PVDF膜上，室温下5%的脱脂奶粉封闭2.0 h，加一抗4℃孵育过夜(抗体工作浓度分别为1∶1 500和1∶500)，加二抗室温孵育4 h。洗膜、显影、定影、曝光,洗片，于凝胶电泳成像仪中成像。

1.5 数据处理

2 实验结果

2.1 各组大鼠血糖浓度和24 h UAE含量的变化

如表1所示，B组和C组大鼠的血糖浓度和24 h UAE与干预前(0周)的A组相比，均明显增加(均P<0.01)。与A组比较，B组大鼠血糖浓度和24 h UAE逐渐增多，自第2周起两组相邻两周同时间点比较，差异呈极显著性(均P<0.01)。自第4周开始，运动干预的C组大鼠的血糖浓度和24 h UAE含量均有所下降，第6周下降尤为明显，与B组同期相比，其差异均有显著性(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组大鼠血糖浓度和24 h UAE含量的变化

2.2 各组大鼠肾脏T-SOD活性、MDA含量的变化

从表2可看出，与A组相比，B组大鼠肾脏的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性明显降低(P<0.01)，而丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.01)；与B组相比，C组大鼠肾脏的T-SOD活性上升明显(P<0.01)，MDA含量明显下降(P<0.05)。

表2 干预第6周末各组大鼠肾脏T-SOD活性、MDA含量的变化

2.3 电镜下足细胞超微结构的改变

电镜下可见，A组大鼠足细胞排列整齐，未见明显异常；基底膜厚度均匀。与A组相比，B组大鼠可见足细胞排列明显紊乱，足突间距增宽，融合增加、甚至消失；基底膜呈节段性增厚。运动干预的C组大鼠较B组上述症状明显减轻(图1)。

2.4 各组大鼠肾组织NF-κB-p65免疫组化检测结果

免疫组化结果显示，A组大鼠肾皮质内NF-κB-p65几乎不表达；B组大鼠肾皮质NF-κB-p65蛋白表达较A组明显增加，其差异呈显著性(P<0.01)；6周有氧运动干预的C组大鼠，其肾皮质NF-κB-p65蛋白表达明显降低，与B组比较，差异亦呈显著性(P<0.05，图2)。

图1 3组大鼠肾小球电镜下的病理变化示意图

图2 分组大鼠肾组织NF-κB-p65 免疫组化染色检测示意图 (×100)

表3 各组大鼠肾皮质NF-κB-p65的平均光密度值的变化

2.5 各组大鼠肾组织Activated Caspase-3、Nephrin Western-blotting检测结果

由图3和图4可知，B组大鼠肾皮质组织Activated Caspase-3的表达水平较A组明显升高(P<0.01)，其肾皮质Nephrin的表达水平明显低于A组(P<0.01)。6周游泳运动干预后，C组大鼠肾皮质的Activated Caspase-3蛋白表达较B组显著降低(P<0.05)，但仍高于A组水平(P<0.01)；而C组大鼠肾皮质的Nephrin蛋白表达较B组明显增加，其差异有统计学意义(P<0.01)，亦显著低于A组(P<0.05)。`

3 分析与讨论

3.1 运动训练对2型糖尿病大鼠血糖、微量蛋白尿及肾脏形态学的影响

Nielsen等研究表明[13]，2型糖尿病肾脏损害早期的主要临床标志即微量蛋白尿(Urinary albumin excretion，UAE)，在糖尿病患者出现此症状时，其肾功能已开始下降。

图3 各组大鼠肾组织Activated Caspase-3蛋白相对表达量的变化示意图

图4 各组大鼠肾组织Nephrin蛋白相对表达量的变化示意图

由表1实验结果显示，糖尿病安静组(B组)和运动干预的糖尿病组(C组)的UAE在干预前已明显高于正常对照组(A组)，说明本实验制作的2型糖尿病模型大鼠，其肾功能在干预前已存在障碍。实验中发现，B组大鼠随着血糖浓度的逐渐增加，UAE的排泄量也相继出现升高，其肾功能相继下降明显，对糖尿病肾脏的损害也进一步加重，与前人研究相一致[18]。电镜下观察肾脏的形态学改变，是肾脏结构损伤的最直接证明。镜下可见B组大鼠出现肾小球3层结构不清，基底膜呈节段性增厚，足细胞排列紊乱、多数足细胞融合甚至消失等病理现象。进一步从形态学方面佐证本实验模型大鼠已出现足细胞损伤及2型糖尿病肾脏早期受损的现象[15]。6周有氧游泳运动干预后，模型大鼠血糖浓度、24 h UAE的排出、肾小球足细胞和基底膜损伤较未干预组明显得到改善，提示，有氧游泳训练除了能明显降低2型糖尿病肾损伤大鼠的血糖水平，还能有效提高其肾功能，一定程度减轻肾损伤的作用，与多数有氧运动研究相一致[1，7，15]。

3.2 运动训练对氧化应激介导的2型糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65及相关蛋白表达的影响

已有研究表明[9，11]，Nephrin蛋白的表达异常或缺失，可导致SD结构的丧失，蛋白尿的出现和肾功能衰竭。Langham等[9]在研究糖尿病伴蛋白尿患者和糖尿病实验模型中已证实，Nephrin mRNA和蛋白表达的降低与蛋白尿的增加呈线性关系。本研究采用Western-blot方法检测到B组大鼠肾脏Nephrin蛋白表达显著低于A组，结合电镜观察结果和表1实验数据，说明本模型大鼠Nephrin蛋白的丢失引起了微量蛋白尿出现，导致大鼠肾脏结构的破坏,与前人报道相似[24]。

此前的研究已表明，有氧运动能保护2型糖尿病受损肾脏，但运动的肾保护效应是否通过影响Nephrin蛋白的表达实现？其作用机理是什么？目前尚不明确。为此，本研究检测了运动干预的C组大鼠肾脏Nephrin蛋白表达，发现C组大鼠的Nephrin蛋白表达水平较B组明显上升。实验结果同时表明，与B组相比，C组大鼠肾功能和肾小球基底膜及足细胞损伤均得到改善，提示，运动抗足细胞损伤的肾保护作用可能与恢复Nephrin蛋白表达有关。目前少见足细胞Nephrin蛋白与有氧运动抗糖尿病肾脏损伤实验方面的研究报道。多种病因可引起糖尿病肾小球足细胞损伤，引起Nephrin蛋白表达缺失[9]。有研究发现[25]，氧化应激与Nephrin的表达缺失密切关联。在本实验结果中也得到了证明：B组大鼠肾脏在Nephrin表达降低的同时，T-SOD活性降低，MDA含量增高，提示，本模型大鼠足细胞损伤与肾组织抗氧化能力下降有关。通过对运动干预组氧化应激指标的测试发现，肾组织中T-SOD活性显著增加，而MDA含量明显减少，提示，运动减少Nephrin蛋白缺失发挥肾保护作用可能与其减少糖尿病大鼠肾脏氧化应激反应有关。氧化应激/ Nephrin蛋白在运动抗糖尿病大鼠肾脏损伤中具体的作用机制尚不清楚。

研究又知，高糖状态下，体内的慢性高血糖促进了氧化应激的生成，集中激活应激敏感的细胞内信号通路，如NF-κB信号、p38MAPK等间接损伤细胞[20]。核转录因子NF-κB，未被应激情况下，以无活性形式存在于胞浆中，一旦受到TNF-a、氧化应激等刺激，NF-κB被激活转位至细胞核内，在胞核中活化的NF-κB可通过诱导下游基因的表达上调引起肾脏细胞凋亡，从而导致肾脏损伤[3，5，22]。本研究显示了相似的结果，B组大鼠肾小球内NF-κB-p65(NF-κB的活化形式)呈强阳性表达，其蛋白表达水平明显高于A组，同时大鼠体内血糖和氧化应激水平也明显升高，结合大鼠肾脏病理变化结果，推测，本模型糖尿病大鼠体内的慢性高血糖促进了氧化应激的生成[6，20]，而氧化应激诱导的NF-κB表达增加[6]，可能参与了糖尿病早期出现的足细胞损伤。另有研究显示，有氧运动可抑制炎症因子TNF-a的产生，并增加1κB表达，抑制NF-κB的活化[19]。有研究也指出，高糖下氧化应激可通过不同的机制来增加如TNF-a、TGF-β等细胞因子的产生，并可加快肾小球病变速度[23]；在糖尿病肾病中氧化应激是TNF-a的上游效应因子，可相互作用，激活NF-κB通路介导肾脏损伤[4]。本研究显示，经6周的实验干预后，糖尿病大鼠肾组织的氧化应激水平明显降低，同时NF-κB-p65蛋白表达亦明显下调，提示，有氧运动可能通过抑制2型糖尿病大鼠肾组织中氧化应激的生成直接或间接减弱NF-κB-p65的过表达引起的肾脏损伤效应。目前少见有关有氧运动与2型糖尿病肾脏氧化应激和NF-κB-p65之间的关系研究。

Caspas-3是细胞凋亡的主要效应因子和关键酶蛋白。本研究氧化应激介导的NF-κB活化，是否可诱导2型糖尿病大鼠肾脏效应蛋白Activated Caspase-3的表达增加？NF-κB诱导表达增加的Activated Caspase-3又是否能引起足细胞功能蛋白Nephrin的表达减少，从而影响足细胞功能？目前对此的直接报道较少。本实验结果进一步发现，B组与A组相比，大鼠肾脏NF-κB-p65蛋白表达增加的同时，Activated Caspase-3(Caspase-3的活化形式)表达明显上升，而Nephrin蛋白的表达却显著降低，提示，本研究Activated Caspase-3的表达增多和足细胞Nephrin的下调有可能依赖于NF-κB的过度激活。有证据表明，在肾脏组织内，细胞凋亡发生后，可引起足细胞数目和足细胞上Nephrin的缺失，从而影响肾小球通透性增加和足细胞结构的受损[12，14，15]。结合本研究大鼠肾小球足细胞病理改变结果，可以推测，NF-κB的过表达有可能通过上调Activated Caspase-3效应蛋白的表达诱导大鼠肾脏细胞发生凋亡性损伤[6，23]，继而引起足细胞Nephrin的表达缺失，从而导致SD糖尿病模型大鼠足细胞损伤和肾脏结构的破坏及肾功能的降低。此外，本实验还发现，6周实验干预后，糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65表达明显降低的同时，Activated Caspase-3蛋白显著减少，而Nephrin蛋白表达则明显增加，UAE排出量明显减少，足细胞结构明显改善。以上提示，有氧运动有可能通过抑制糖尿病状态下氧化应激介导的NF-κB-p65激活，下调Activated Caspase-3蛋白表达来减少Nephrin蛋白缺失，进而作用于足细胞，改善足细胞结构，从而减少蛋白尿的排泄，最终减轻对糖尿病肾脏的损害。这在有关NF-κB-p65和相关蛋白(Activated Caspase-3、Nephrin)与有氧运动抗糖尿病肾脏损伤的实验研究中鲜有报道，本研究发现，有氧游泳运动能明显下调NF-κB-p65蛋白水平，继而减弱由其效应蛋白Activated Caspase-3和Nephrin引起的2型糖尿病大鼠肾脏损伤效应。

4 小结

在本实验条件下，6周有氧游泳训练可以影响2型糖尿病大鼠血糖，改善其肾功能，并减轻大鼠肾脏早期损伤。其机制可能与运动的抑制氧化应激介导的2型糖尿病大鼠肾脏NF-κB-p65的激活，改善效应蛋白Activated Caspase-3异常表达来恢复足细胞Nephrin蛋白的表达，而改善大鼠肾脏损伤的保护作用有关。在有效控制血糖的基础上，氧化应激/NF-κB-p65及相关蛋白(Activated Caspase-3、Nephrin)有可能成为运动训练改善2型糖尿病肾病变的新靶点。

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本刊声明

《体育科学》为国家社会科学基金资助期刊，不收取任何费用，特此声明。

《体育科学》编辑部

2016年8月10日

The Effects and Mechanism of Exercise Training on the Expression of NF-κB-p65 and Related Protein in kidney Tissue of Type 2 Diabetes Rats

ZHU Hong-zhu1，RUAN Xiao-juan1，ZHU Mei-ju1，ZENG Zhi-gang1，XIAO Guo-qiang2

Objective: To investigate the effect of exercise training on NF-κB-p65 and related proteins in type 2 diabetic rats and its mechanism.Methods: The model of type 2 diabetic rats was established through SD rats fed high-fat diet for six weeks together with intraperitoneal infecting after a low dose of STZ.The model rats were randomly divided into diabetic control group(B)and diabetic exercise group(C)with intervention of exercise for six weeks,additionally provided normal control group(A)without any intervention.We examined blood glucose concentrations and the excretion of 24 h microalbuminuria(UAE),and T-SOD activity and MDA content and the expressions of NF-κB-p65,Activated Caspase-3 and Nephrin in the renal cortex and glomerular ultrastructure changes were observed by electron microscope after the experiment end.Results: 1) Group B could be found that it had glomerular wall oozing with the adhesions and part of telangiectasia,obvious glomerular basement membrane foot process fusion and so on,while the above glomerular injury improved significantly in Group C with exercise through electron microscope.2) Compared with Group B,the concentrations of blood glucose and 24 h UAE in Group C decreased significantly (P<0.05 orP<0.01).3) Compared with Group B,the activity of T-SOD in Group C increased significantly,while the content of MDA decreased significantly (P<0.05 orP<0.01).4) Compared with Group B,the expressions of NF-κB-p65 and Activated Caspase-3 significantly decreased,while Nephrin in Group C of the renal cortex significantly increased (P<0.05 orP<0.01).Conclusion: Exercise could improve blood glucose and renal function,and decrease renal injure for type 2 diabetes,which may be related to decreasing the protein over-expression of NF-κB-p65 induced by oxidative stress and Activated Caspase-3 activity,while increasing of Nephrin expression in type 2 diabetes after exercise.

type2diabetes；exercisetraining；renalinjury；NF-κB-p65；relatedproteins；rats

1000-677X(2016)08-0050-06

10.16469/j.css.201608004

2016-03-02；

2016-06-24

国家自然科学基金项目(31360255)；江西省教育厅科技项目(GJJ150770)；井冈山大学自然科学研究项目(JZB1313)。

朱洪竹(1971-)，女，湖南娄底人，讲师，博士，主要研究方向为运动与慢性病防治的机理研究，Tel:(0796)8100491，E-mail：zhuhongzhu 2007 @163.com；肖国强(1949-)，男，湖北武汉人，教授，博士，博士生导师，主要研究方向为运动生理学，Tel:(020)39310273，E-mail：Xiaogqde163.com；阮晓娟(1971-)，女，江西吉安人，讲师，硕士，主要研究方向为运动与健康，Tel:(0796)8100491，E-mail：465497200@qq.com。

1.井冈山大学 体育学院，江西 吉安 343009；2.华南师范大学 体育科学学院，广东 广州 510006 1.Jinggangshan University,Ji’an 343009,China；2.South China Normal University,Guangzhou 510631,China.

G804.7

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