Graves病患者外周血中Th17细胞及相关细胞因子的表达

李红林 邓之奎 郑云会 刘艳秋 刘小宁 杨士军 陆卫军 高美华

(南京医科大学附属淮安第一医院，淮安223300)



Graves病患者外周血中Th17细胞及相关细胞因子的表达

李红林 邓之奎 郑云会 刘艳秋 刘小宁 杨士军 陆卫军 高美华①

(南京医科大学附属淮安第一医院，淮安223300)

目的：研究Graves病患者外周血中Th17细胞及IL-17、IL-23的表达水平并探讨其临床意义。方法：用流式细胞仪检测29例Graves病患者治疗前后(GD组，GD缓解组)和29名健康对照者(NC组)外周血PBMC中CD4+IL-17+T细胞比例,用ELISA法检测血清中IL-17和IL-23浓度，用电化学发光法检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)水平，用放射受体分析法测定抗促甲状腺激素受体抗体(TrAb)水平。结果：3组之间年龄、性别差异均无统计学意义(F=0.007 5，P>0.05；χ2=0.4213，P>0.05)。GD组和GD缓解组Th17比例、IL-17、IL-23的水平显著高于NC组，差异有统计学意义(P均<0.05)。GD缓解组的Th17比例、IL-23浓度显著低于GD组，但GD缓解组IL-17浓度与GD组的差异无统计学意义(P>0.05)。Th17比例、IL-17、IL-23与FT3、FT4、TrAb均呈正相关(r值依次为：0.588 2、0.337 2、0.371 0；0.549 6、0.287 5、0.342 7；0.361 0、0.420 8、0.330 8；P均<0.05)。Th17比例、IL-17、IL-23与TSH均呈负相关(r值依次为-0.319 7、-0.472 8、-0.428 2；P均<0.05)。结论：Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23在GD患者外周血中均高表达；并与GD患者的甲功4项指标具有不同程度的相关性。Th17细胞及相关细胞因子IL-17、IL-23能够作为GD的生物学标记物。

Graves病；Th17细胞；IL-17；IL-23/IL-17炎症轴

格雷夫斯病(Graves disease,GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，以甲状腺弥漫性增大和功能亢进为主要特征，并可引起全身多系统高代谢表现[1]。近年来，随着人们生活压力的加大和全民食用加碘盐的普及，GD的患病率具有增加趋势[2]，且25%～50%的GD患者会发展成Graves眼病，严重威胁着人类的健康。GD的发病机制目前尚不完全明确。曾有研究表明GD的发生与Th1和Th2细胞的免疫平衡失调有关[3]，但最近研究表明，Th17细胞也参与了导致GD发病的免疫紊乱过程[3]。IL-23是诱导Th17细胞分化成熟的促进因子[4]，IL-17则是Th17细胞的特征性细胞因子和主要效应因子[5]，它们一起组成了以Th17细胞为核心的IL-23/IL-17免疫炎症轴，通过募集巨噬细胞和中性粒细胞到达炎症部位，促进炎症反应。本文就GD患者治疗前后外周血中Th17细胞和IL-17、IL-23的表达水平变化情况及其与甲状腺功能指标间的关系进行了研究，以探讨在GD发病期间IL-23/IL-17炎症轴所起的作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选自2013年3月至2015年2月在淮安市第一人民医院就诊或体检的人员。参照《中国甲状腺疾病诊治指南》[1]内容将其分成3组：(1)GD初诊组(GD组)29例(男10例，女19例)，平均年龄(40.7±15.0)岁；均为未经治疗且初次诊断为GD的患者；(2)GD治疗缓解组(euthyroid GD group,eGD组)29例；为上述初诊的GD组患者经甲巯咪唑正规治疗3～9个月后，临床症状明显缓解，FT3、FT4水平恢复正常者。(3)健康对照组(NC组)29例(男8例，女21例)，平均年龄(41.1±7.2)岁；为同期的健康体检者，无甲状腺疾病史和家族史、无甲亢症状和体征、甲状腺功能正常、自身抗体检测结果均为阴性。所有研究对象均未使用激素、免疫抑制剂等药物；并排除妊娠、感染、肿瘤、过敏性疾病、肝肾功能异常及其他自身免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 仪器试剂 Th17细胞检测采用美国BD公司FACSCanto II流式细胞仪及流式结果分析系统；RPMI1640培养液、Hank′s 液购自Gibco公司,CD45-PerCP-cy5.5单克隆抗体、抗人CD4-FITC单克隆抗体、抗人APC-IL-17A单克隆抗体、核内染色用固定破膜剂等均购自BD公司，佛波酯、离子霉素、莫能霉素均购自Sigma公司。检测IL-17、IL-23浓度用ELISA法,试剂盒由美国RB(Rapidbio)公司提供，仪器采用北京普朗公司的DNM-9602型酶标仪；检测FT3、FT4和TSH水平用电化学发光法，仪器采用Roche公司生产的 E170 模块型电化学发光免疫分析仪，试剂为专用配套试剂；检测TrAb水平用放射受体分析法，德国ME-DIPANDIACNOSTICA公司提供试剂盒,仪器用中国科大中佳公司GC-911型γ免疫计数仪。所有操作均严格按产品说明书进行。

1.2.2 标本采集及处理 收集研究对象的临床数据，并用EDTA-K2真空采血管采集静脉血2 ml，混匀，于常温环境中2 h内提取外周血单个核细胞(PBMC)供流式细胞学检测，另用促凝真空管抽取静脉血5 ml，2 500 r/min 20 min，分离血清后立即检测FT3、FT4、TSH和TrAb等指标，然后将血清标本分装于EP管中，密封置-20℃冰箱保存，以备用ELISA法成批检测各种细胞因子。

1.2.3 Th17细胞检测 用RPMIl640培养液重悬PBMC并调整细胞密度为2.5×1010L-1；然后以每孔1 ml接种于24孔板，并分别加入佛波酯25 ng/ml、离子霉素1 μg/ml、莫能霉素300 μg/L；放37℃、5%CO2细胞培养箱5小时；收集细胞并调整细胞浓度后分装于测定管和对照管；分别加入CD45-PerCP-cy5.5单克隆抗体,CD4-FITC单克隆抗体和IgG1-FITC抗体对细胞染色；用抗人APC-IL-17A单克隆抗体对细胞内因子进行染色，采用流式细胞仪检测分析CD4+IL-17+(Th17细胞)占CD4+细胞比例。

2 结果

2.1 性别、年龄和甲状腺功能比较 研究组的性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)。GD组的FT3、FT4和TrAb水平均显著高于NC组和eGD组(P<0.05)，TSH浓度显著低于NC组和eGD组(P<0.05)。eGD组的FT3、FT4浓度与NC组的差异无统计学意义(P>0.05)，但TSH浓度显著低于NC组、TrAb浓度则显著高于NC组(P<0.05)(见表1)。

2.2Th17细胞及IL-17、IL-23的比较GD组和eGD组的Th17比例、IL-17、IL-23浓度均显著高于NC组(P<0.05)；eGD组的Th17比例、IL-23浓度显著低于GD组，但eGD组IL-17浓度与GD组的差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2，图1。

表1 各研究组的一般资料比较

Tab.1 Comparison with general information among three study groups

GroupsNCgroupGDgroupeGDgroupGenders(M/F)8/2110/19Age(year)41.1±7.240.7±15.0FT3(pmol/L)4.75±0.6919.46±8.901)5.28±1.992)FT4(pmol/L)12.30±2.6749.71±22.681)12.42±4.442)TSH(mU/L)1.79±0.380.02±0.021)1.08±1.401)2)TrAb(U/L)1.49±0.5021.16±13.221)9.11±5.831)2)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05；compared with GD group,2)P<0.05.

图1 各研究组外周血中Th17细胞表达的代表性流式细胞图Fig.1 Representative flow cytometric graphs of Th17 cells in each research group

图2 外周血中甲功4项指标与IL-17/IL-23炎症轴3项指标的相关性Fig.2 Correlation between 4 thyroid function items and 3 IL-17/IL-23 axis items

表2 外周血Th17细胞比例和IL-17、IL-23水平比较

Tab.2 Difference of proportion of peripheral Th17 cells and plasma concentrations of IL-17 and IL-23 among three study groups

GroupsNCgroupGDgroupeGDgroupCD4+IL-17+lymphocytes(%)0.65±0.221.34±0.511)1.04±0.211)2)IL-17(pg/ml)583.77±155.86841.35±124.671)798.52±116.451)IL-23(pg/ml)825.73±127.362054.15±759.161)1659.55±726.871)2)

Note：Compared with NC group,1)P<0.05；compared with GD group,2)P<0.05.

2.3 相关性分析 采用Spearman分析各检测指标间的双变量相关性:外周血中的Th17比例、IL-17、IL-23水平与血清中TSH浓度均呈显著负相关(P均<0.05)，与FT3、FT4、TrAb水平均呈显著正相关(P均<0.05)。详见图2。

3 讨论

GD是由于靶器官甲状腺发生特异性自身免疫反应而发生一种疾病，其主要特征是患者甲状腺组织中出现大量淋巴细胞浸润和血清中出现TrAb等自身免疫性抗体。Th17细胞是在实验建立自身免疫性脑脊髓炎和胶原诱导性关节炎模型中发现的一种全新的CD4+T淋巴细胞亚型[5]。它由细胞因子IL-6和TGF-β共同启动分化发育[6]，然后由IL-23诱导分化成熟并产生效应因子IL-17；同时由IFN-γ、IL-4等负向调控分化过程[7]。研究报道Th17细胞分化成熟过程中的相关细胞因子IL-6、TGF-β1、IFN-γ和IL-17等在发病初期的GD患者血清中均高表达[8]。本文结果显示Th17细胞在治疗前的初发GD患者外周血中水平也显著高于正常对照组，与王玫等研究结果相似[9]；患者经治疗缓解后，Th17细胞表达水平显著下降，但仍高于正常对照组。相关性分析显示，Th17细胞与FT3、FT4、TrAb均呈正相关，与TSH均呈负相关。上述内容均提示Th17细胞可能参与GD的病变过程，并与病变程度有关。

IL-23由p19和IL-12的p40亚基以二硫键形式连接而成，是IL-12细胞因子家族的新成员。主要由活化的B细胞和单核巨噬细胞产生。IL-23通过结合靶细胞表面的IL-23R，剌激STAT4的磷酸化，促进CD4+T细胞增殖、维持Th17细胞活性、并诱导Th17细胞分泌IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-17F等细胞因子，形成IL-23/IL-17炎症轴。其中IL-17是Th17细胞的特征性细胞因子，也是一个较强的促炎性细胞因子，具有刺激人成纤维细胞表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，募集巨噬细胞和中性粒细胞到达甲状腺炎症部位，并通过MAPKs激酶途径、核转录因子C/EBPs和kB(Nuclear factor κB，NF-κB)等途径促进T淋巴细胞和中性粒细胞的分化增殖、成熟、活化[10]，介导炎症反应。

本文结果显示IL-17、IL-23在治疗前的初发GD患者外周血中水平均显著高于正常对照组；患者经治疗缓解后，IL-23的表达显著下降，但仍高于正常对照组，而IL-17的表达水平在治疗前后则没有显著性变化，与Zheng L等报道的结果相一致[11]。相关性分析显示，IL-17、IL-23与FT3、FT4、TrAb均呈正相关，与TSH均呈负相关，与马学芹等报道的结果相一致[12]。提示以Th17细胞为核心的IL-23/IL-17免疫炎症轴可能也参与了GD的发病过程，并通过加重甲状腺局部炎症反应，诱导体液免疫过程中自身抗体的产生，促进GD病程的发展。经有效治疗后，IL-23的表达减少，可能抑制了Th17细胞的分化和IL-17的致炎作用，机体的甲状腺激素和自身抗体水平均得以缓解。

综上所述，Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23等在治疗前后的GD患者外周血中均高表达；并与GD患者外周血中的甲功4项指标具有不同程度的相关性。据此推测Th17细胞及相关细胞因子IL-17、IL-23可能在GD病变过程发挥重要作用，并与病变程度密切相关；IL-23/IL-17炎症轴有望成为GD免疫治疗的新靶点。

[1] 中华医学会内分泌学分会《中国甲状腺疾病诊治指南》编写组.中国甲状腺疾病诊治指南—甲状腺功能亢进症[J].中华内科杂志,2007,46(10)：876-882.

[2] 高 妍.Graves病诊治中的几个问题[J].中华内分泌代谢杂志,2001,17(4):193-194.

[3] Esfahanian F,Naimi E,Doroodgar F，etal.Th1/Th2 cytokines in patients with Graves′ disease with or without ophthalmopathy[J].Iran J Allergy AsthmaImmunol，2013,12(2):168-175.

[4] Peng D,Xu B,Wang Y,etal.A high frequency of circulating th22 and th17 cells in patients with new onset graves′ disease[J].PLoS One，2013,8(7):1-8.

[5] Kürtüncü M,Tüzün E,Türkolu R,etal.Effect of short-term interferon-β treatment on cytokines in multiple sclerosis:significant modulation of IL-17 and IL-23[J].Cytokine，2012，59(2):400-402.

[6] Yang J-J,Feng F,Hong L,etal.Interleukin-17 plays a critical role in the acute rejection of intestinal transplantation[J].World J Gastroenterol，2013，19(5):682-691.

[7] Park H,Li Z,Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflamemation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol，2005，6(11):1133-1141.

[8] Yang L,Anderson DE,Baecher-Allan C,etal，IL-21 and TGF-beta are required for differenti-ation of human T(H)17 cells[J].Nature，2008，454(7202):350-352.

[9] Iezzi G,Sonderegger I,Ampenberger F,etal，CD40-CD40L cross-talk integrates strong antigenic signals and microbial stimuli to induce development of IL-17-producing CD4+T cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(3):876-881.

[10] 李红林,高美华,郑云会，等.细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17和TGF-β1在Graves病发病中的作用[J].中国免疫学杂志，2015，31(2):253-256.

[11] 王 玫,任 安,孔艳华,等.Graves病患者外周血Th17细胞的变化及意义[J].安徽医科大学学报,2013,48(6):682-684.

[12] Kwok SK,Cho ML,Her YM,etal.TLR2 ligation induces the production of IL-23/IL-17 via IL-6,STAT3 and NF-κB pathway in patients with primary Sjogren′s syndrome[J].Arthritis Res Therapy，2012，14(2):1-13.

[13] Zheng L,Ye P,Liu C.The role of the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of Graves′ disease[J].Endocr J，2013，60(5):591-597.

[14] 马学芹,于世鹏.初发Graves病患者131I治疗前后IL-23/Th17轴相关因子水平的变化及意义[J].中国免疫学杂志，2013，29(7)：733-735，754.

[收稿2015-06-30 修回2015-10-22]

(编辑 许四平)

Expression of Th17 cells and related cytokines in peripheral blood of patients with Graves′ disease

LI Hong-Lin,DENG Zhi-Kui,ZHENG Yun-Hui,LIU Yan-Qiu,LIU Xiao-Ning,YANG Shi-Jun，LU Wei-Ping，GAO Mei-Hua.Huai′an First Hospital，Nanjing Medical University，Huai′an 223300，China

Objective:To explore the proportions of Th17 cells in the peripheral blood and levels of IL-17,IL-23 in the serum of patients with Graves′ disease(GD)and their clinical significance.Methods: We studied 29 patients with GD(GD group),and reevaluated the GD group after therapy(euthyroid GD group).29 gender-and age-matched volunteers were selected as the normal control(NC group).The proportions of Th17 cells were investigated by flow cytometry.The levels of IL-23，IL-17 in the serums were measured by ELISA.The levels of FT3,FT4,TSH were determined by ECLIA and the levels of TrAb were tested by RRA.Results: There were no significant difference among 3 study groups in sex and age match(F=0.0075,P>0.05;χ2= 0.4213,P>0.05).The proportions of Th17 cells and the levels of IL-17,IL-23 were increased in the GD and euthyroid GD patients compared with the control group(respectively，P<0.05).The proportions of Th17 cells and the concentrations of IL-23 in euthyroid GD group were significantly lower than those of GD group(respectively，P<0.05),but there were no significance in the concentrations of IL-17 between euthyroid GD group and GD group(P>0.05).Correlation analysis revealed that the proportions of Th17 cells ,and the levels of IL-17,IL-23 were positively correlated with the levels of FT3,FT4,TrAb(r=0.588 2,0.337 2,0.371 0；0.549 6,0.287 5,0.342 7；0.361 0,0.420 8,0.330 8；P<0.05，for all parameters),and were negatively correlated with the levels of TSH(r=-0.319 7,-0.472 8,-0.428 2；P<0.05，for all parameters).Conclusion: Th17 cells and their related cytokines IL-17,IL-23 are highly expressed in the serum of patients with GD.Th17 cells and their relative cytokines have certain relevance with 4 thyroid function parameters of the patients with GD ,which can be used as biological markers for GD.

Graves′ disease;Th17 cell;Interleukin-17;IL-23/IL-17 axis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.025

李红林(1980年-)，男，医学硕士，主管检验师，主要从事自身免疫性甲状腺疾病的发病机制研究，E-mail:hayylhl@163.com。

及指导教师：高美华(1953年-)，女，教授，博士生导师，教研室主任，主要从事分子免疫学研究，E-mail:meihuagao66@163.com。

R446.62

A

1000-484X(2016)04-0563-04

①青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071。