重组hIL-10对AA大鼠T淋巴细胞及IL-17A的影响研究①

杜联峰 孙万邦 丁立珉 唐艳丽

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海519041)



重组hIL-10对AA大鼠T淋巴细胞及IL-17A的影响研究①

杜联峰 孙万邦②丁立珉 唐艳丽

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海519041)

目的：以重组人白细胞介素-10(human interleukin-10，hIL-10)及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型，检测T淋巴细胞亚群及IL-17A水平的变化情况，研究重组hIL-10及其联合MTX治疗佐剂性关节炎大鼠的效果。方法：用IL-10、MTX以及IL-10+MTX处理AA大鼠模型，用流式细胞仪测定各组大鼠血液中CD4+T细胞与CD8+T细胞比值，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清IL-17A的含量。结果：各治疗组CD4+淋巴细胞总数与CD4+/CD8+值不同程度下降，各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。各治疗组IL-17A水平有不同程度下降，各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)，联合组与IL-10组比较有显著性差异(P<0.05)。结论：重组hIL-10能下调AA大鼠血液中CD4+T细胞的数量及CD4+/CD8+比值，降低血清中IL-17A水平，联合组较IL-10组对血清中IL-17A影响更显著，提示重组hIL-10联合MTX 在治疗类风湿关节炎中能更好地发挥作用。

重组人白介素-10；佐剂性关节炎；T细胞亚群；IL-17A

类风湿关节炎(Rhematic arthritis，RA)是以慢性进行性关节滑膜以及关节软骨损伤为特征的一种自身免疫性疾病，发病率高[1]。近年研究证实RA发生与免疫调节紊乱有关，T细胞的异常活化及T细胞亚群的平衡失衡与RA的发病密切相关，另外，Th17细胞所分泌的IL-17A在类风湿性关节炎患者中明显升高，并参与了骨关节的损害，是RA发病重要环节之一[2]。IL-10是一种主要由Th2细胞、巨噬细胞等分泌的一种重要免疫抑制性的因子，在人体内主要是由巨噬细胞产生，IL-10被认为是介导下调炎症级联反应中的重要细胞因子，因为它能够抑制活化及效应性T细胞、巨噬细胞和单核细胞的功能，介导免疫抑制的作用[3,4]。研究表明IL-10在RA中主要由关节部位巨噬细胞和T细胞产生，其可通过抑制炎性细胞因子的分泌，减轻关节的肿胀和炎性细胞浸润及炎性渗出物的产生，具有明显的免疫抑制和免疫调节功能，有一定的治疗类风湿性关节炎的前景。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作为一种慢作用抗风湿药，临床上已普遍用于治疗类风湿关节炎，它主要是通过其细胞内代谢产物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTXPG)持续发挥治疗作用[5]。本研究通过应用重组hIL-10及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型，检测血液T淋巴细胞亚群及血清中IL-17水平的变化情况，进一步通过动物实验证实IL-10在RA中的作用，为重组hIL-10在类风湿关节炎的应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级SD大鼠40只，雌性，由广东省实验大鼠中心提供，[许可证号SCXK(粤)2008-0002]。在遵义医学院珠海校区动物实验中心饲养。

1.1.2 主要试剂与实验仪器 anti-rat CD8a PE OX8、anti-rat CD4 FITC OX3购自美国Sigma公司，Rat IL-17A ELISA Kit购自欣博盛生物科技有限公司，流式细胞仪，酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及动物模型的建立 40只SD大鼠编号以后按随机数字表法分为2组：空白对照组8只SD大鼠，AA大鼠模型组32只SD大鼠，AA大鼠模型组造模：将卡介苗于80℃灭活后加入弗氏不完全佐剂中充分乳化混匀配成10 mg/ml的弗氏完全佐剂，于左侧足底皮下注射0.1 ml建立AA模型。20 d后同法加强免疫1次，加强免疫后15 d后造模成功，随机分为4组，即模型对照组、IL-10治疗组、MTX治疗组、IL-10与MTX联合治疗组，每组8只。三个治疗组自造模成功日起通过腹腔给药15 d。给药剂量分别为空白对照组NS 1 ml/kg；IL-10组5 μg/ml；MTX组1 mg/kg；联合组3 μg/kg IL-10+1 mg/kg MTX。

1.2.2 AA大鼠模型构建成功一般情况观测 造模后，观察各组大鼠的精神状态、食量、活动、毛色变化、体温等情况。通过血细胞分析仪检测大鼠外周血液白细胞数量的变化。

1.2.3 T细胞亚群检测 末次给药后，取大鼠外周血50～100 μl于EDTA抗凝管中，每管分别加入抗大鼠FITC-CD4抗体，PE-CD8抗体各10 μl，室温下振荡混匀，避光放置30 min，每管加入溶血素2 ml，裂解红细胞10 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清：每管再加入PBS液2 ml洗涤细胞，500 r/min离心5 min，弃上清，加入多聚甲醛10滴重悬细胞，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4 血清IL-17A检测 各组末次给药后通过内眦采血2 ml，分离血清，ELISA法检测血清中细胞因子IL-17A水平。

2 结果

2.1AA模型大鼠构建成功 大鼠行为学改变：模型组大鼠于注射弗氏完全佐剂后开始出现不同程度食欲下降，皮毛耸立、足关节肿胀，造模后第2天注射局部出现红肿，皮温升高(图1)。造模后大鼠出现体重减轻、进食量减少、跛行、活动减少等症状。对照组未出现上述表现。

血液中白细胞数量变化情况：模型组大鼠外周血白细胞总数与正常对照组比较明显升高(表1)，有显著差异(P<0.05 )。

2.2 实验大鼠T细胞亚群测量结果 与空白对照组相比，模型组的大鼠外周血中CD4+T淋巴细胞的百分比含量明显升高，两组之间有显著性差异(P<0.01)，CD8+T淋巴细胞的百分比无明显变化，两组之间无显著性差异(P>0.05)，模型组CD4+/CD8+T淋巴细胞比值升高，两组之间有显著性差异(P<0.05)。各治疗组与模型组相比CD4+T淋巴细胞数均有不同程度降低(P<0.05)，其中联合组与IL-10组、MTX组比较有显著差异(P<0.05 )，说明联合用药组对CD4+T淋巴细胞的调节作用比单用IL-10或MTX要好。CD8+T淋巴细胞计数显示各治疗组与模型组和空白对照组比较，CD8+T淋巴细胞数均有不同程度升高(P<0.05)，但各治疗组调节CD8+T淋巴细胞水平无统计学差异(P>0.05)，各治疗组与模型组比较，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值降低，说明各治疗组能下调CD4+/CD8+细胞比值，治疗组能调节T细胞亚群的平衡，见表2。

图1 模型组大鼠足关节红肿Fig.1 Model group rat paw joint swelling

表1 各组大鼠外周血白细胞数量的变化(WBC×109L-1)

Tab.1 Levels of leukocytes in peripheral blood of rates(WBC×109L-1)

GroupsBefcremodelingAftermodeling20dAftermodeling35dNormal6.39±0.816.18±1.326.26±0.75Model6.58±1.4521.7±2.311)20.16±2.071)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05.

GroupsCD4+CD8+CD4+/CD8+Normal31.46±2.951)20.39±2.951.11±0.391)Model41.75±4.5420.27±1.692.05±0.06hIL-1037.80±0.251)23.02±1.141)1.61±0.061)MTX36.74±0.541)22.21±1.131)1.63±0.041)Joint35.01±1.101)2)3)22.06±0.891)2)1.56±0.151)

Note：Compared with model group,1)P<0.05；compared with IL-10 group,2)P<0.05；compared with MTX,3)P<0.05.

GroupsIL-17A(ng/L)Normal111.04±11.151)Model258.41±15.15IL-10186.24±13.411)MTX128.61±13.571)2)Joint112.31±15.091)2)

Note：Compared with model group,1)P<0.05 ；compared with IL-10 group,2)P<0.05.

2.3 IL-17A动态检测结果 模型组的AA大鼠血清中IL-17A水平显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，各治疗组与模型组相比血清中IL-17A有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其中MTX组、联合组与IL-10组比较有显著差异(P<0.05 )，说明MTX和联合用药组的效果要比单用IL-10好，但是联合用药组与MTX组比较，IL-17A水平下降最多，说明联合用药较单用MTX更有效。见表3。

3 讨论

RA通常是由于机体对自身抗原外周免疫耐受失衡导致自身反应性效应细胞异常扩增而引发的组织特异性炎症反应。在RA的发病机制中T细胞的作用被认为是有非常重要作用的。在RA发病过程中CD4+Th1细胞的活化被认为是炎性效应细胞诱发关节炎症反应的重要因素。在机体正常状态下，CD4+/CD8+T淋巴细胞比例维持在一个动态平衡的状态，是机体免疫功能的一项重要指标[6]，近年来研究表明在类风湿性关节炎患者体内CD4+/CD8+T淋巴细胞比例失衡。最近研究在 RA患者中自身IgG抗体反应的特异靶点[7,8]，通过分析表明：这些特异靶点能够与自身HLA结合，从而诱发自身反应性CD4+T细胞异常激活和扩增，导致关节局部滑膜细胞，成纤维细胞，单核细胞的聚集和上调黏附分子的表达并进一步促进促炎细胞因子和趋化因子的分泌，包括IL-1、IL-6、IL-8、MIP-I等[9]。这些细胞因子直接参与骨关节炎症反应，加重骨关节的炎症病理损伤。本实验结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠外周血CD4+T细胞含量明显升高，CD8+T细胞含量无明显变化，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值升高。经过治疗后，各治疗组与模型组相比，CD4+T淋巴细胞数均有不同程度降低，CD8+T淋巴细胞数均有不同程度升高，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值降低。这些结果表明在佐剂性关节炎大鼠体内存在T细胞免疫功能失调，自身反应性CD4+T细胞异常活化和扩增，导致CD4+T淋巴细胞数升高，从而导致骨关节炎症的发生和发展。本研究结果表明，与模型组比较通过重组IL-10、MTX及其IL-10+MTX联合治疗后，CD4+T淋巴细胞数量下降，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值降低，这些结果说明IL-10可以抑制活化及效应性CD4+T细胞功能，介导免疫抑制的作用，从而减轻骨关节的炎症反应和损伤，IL-10和MTX联合应用与单用MTX对CD4+T细胞数及CD4+/CD8+T细胞比例无显著性差异。本研究在AA大鼠模型治疗15天后，IL-10组和MTX组及其联合用药组的关节病变与模型组相比较，病变程度有所减轻，足关节软组织肿胀度明显降低，以联合用药组的效果最明显，大鼠活动能力明显增强，说明IL-10可以增强MTX对类风湿性关节炎的治疗效果。

IL-17A是由Th17细胞产生的促炎性细胞因子，IL-17家族包括六个成员(A-F)，各个细胞因子间大约有20%～30%的相同序列[10]，研究发现IL-17A在类风湿性关节炎患者滑膜中表现出与疾病严重程度相关的细胞因子，在患者体内发挥多种生物学活性，参与炎症及骨关节滑膜细胞的损伤，在RA的病理过程中扮演着重要的角色[11]。研究表明类风湿性关节炎动物模型中抑制IL-17A的作用可以明显抑制关节炎症状，减轻局部炎症反应的发生，主要因为IL-17A可以刺激类风湿性关节炎关节滑膜细胞中IL-6和IL-8的表达[12]，上调软骨细胞及滑膜成纤维细胞金属蛋白酶的表达，从而参与骨及软骨的破坏、血管新生促进软骨蛋白多糖及胶原降解，抑制软骨细胞蛋白的合成[13]。本实验通过检测IL-17A水平，模型组的AA大鼠血清中IL-17A水平显著高于空白对照组，各治疗组与模型组相比血清中IL-17有不同程度降低，这些结果说明IL-10可以抑制AA大鼠体内Th17细胞功能，减少IL-17A的释放，从而减轻骨关节的炎症反应和损伤，IL-10与MTX联合应用与单用IL-10治疗对IL17A水平的影响有显著性差异，治疗可以取得更好的效果。

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[收稿2015-08-01]

(编辑 许四平)

Effect of recombinant hIL-10 on lymphocytes and IL-17A of an AA rat model

DU Lian-Feng，SUN Wan-Bang，DING Li-Min，TANG Yan-Li.Zhuhai Campus Zunyi Medical College/Graduate Education and Innovation Base of Immunology in Guizhou Province，Zhuhai 519041，China

Objective:Adjuvant arthritis(AA)rats interfered with recombinant hIL-10,methotrexate(MTX)separately,we detected the changes of T cell subsets in rat′s blood and IL-17 A in rat′s serum.Methods: AA rats interfered with recombinant hIL-10,MTX and IL-10 plus MTX.The changes of the CD4+and CD8+T cell subsets were detected by flow cytometry;the Levels of IL-17A in serum of rats were measured by ELISA method. Results: Compare to normal control group,the CD4+T cell total quantity and CD4+/CD8+T cell Proportion was significantly decreased,there were significant differences between the treatment group and the untreated group(P<0.05),the IL-17A of treatment group was significantly decreased,there was a significant differences(P<0.05).The combination group had significant difference compared with IL-10 group.Conclusion: Recombinant hIL-10 can down-regulate the blood of AA rats in the number of CD4+T cells and CD4+/CD8+ratio,reduce serum levels of IL-17A.The combination group compared with the IL-10 group effect on serum IL-17A more significantly,the results displayed recombinant hIL-10 plus MTX in the treatment of rheumatoid arthritis can better play the role.

Recombinant hIL-10；Adjuvant arthritis；T cell subsets ；Interleukin-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.005

①本文受贵州省教育厅自然科学重点培育项目(2008032)资助。

杜联峰(1976年-)，男，硕士，副教授，主要从事分子免疫学研究，E-mail：8wy149842@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0476-04

②通讯作者，E-mail：sunwb7224@sina.com。