转录因子Foxp3对人肺腺癌细胞A549增殖周期的影响及机制研究

刘亚庆 赵 博 罗亚东 李祎南 杨 巍

(吉林大学基础医学院免疫学系,长春130021)



转录因子Foxp3对人肺腺癌细胞A549增殖周期的影响及机制研究

刘亚庆 赵 博 罗亚东 李祎南 杨 巍

(吉林大学基础医学院免疫学系,长春130021)

目的：研究Foxp3对肺腺癌细胞A549增殖及细胞周期的影响，并探讨相关调控机制。方法：采用siRNA沉默A549细胞Foxp3表达；MTT法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞周期变化；RT-PCR筛选细胞周期相关checkpoint基因；免疫荧光及双荧光素酶报告基因分析Foxp3对相关checkpoint基因调控机制。结果：沉默A549细胞Foxp3后，其增殖明显减慢并发生G0/G1期阻滞，G1/S期checkpoint基因CCND1表达显著降低。机制研究发现Foxp3能直接调控CCND1表达。结论：Foxp3通过上调细胞周期G1/S期checkpoint基因CCND1表达，促进肺腺癌细胞A549增殖，从而促进了肺腺癌发展，为肺腺癌的发生发展及治疗靶点提供了新思路。

Foxp3；CCND1；肺腺癌；增殖；细胞周期

Foxp3(Forkhead box protein 3)是叉头/翼状螺旋转录因子家族成员之一，最初被发现表达于CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Tregs)，是其特异的标志物，也是维持其免疫抑制功能的关键调节基因。在某些肿瘤中，如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等，外周血和肿瘤局部Foxp3+Tregs增多，能抑制多种免疫细胞的作用，促进肿瘤免疫逃逸[1]，与肿瘤进展及不良预后关系密切[2]。而近年研究发现Foxp3不仅在Tregs表达，在多种肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达，但是发挥的作用、与预后的关系却不尽相同。在舌鳞状细胞癌、肝癌、胃癌中，Foxp3表达与不良预后呈正相关，发挥促癌作用[3,4]；而在前列腺癌、乳腺癌中，Foxp3高表达者预后较好，Foxp3发挥抑癌作用[5,6]。恶性肿瘤的发生发展是多基因参与的过程，表现为细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为调节异常，这是影响患者预后的重要因素。因此，肿瘤细胞Foxp3可能改变了肿瘤细胞的生物学行为，进而促进或抑制肿瘤的发生发展，影响患者预后。增殖是细胞的重要生命特征，在胃癌、黑色素瘤中，Foxp3对肿瘤细胞增殖的影响也不一致[7,8]。肿瘤细胞能够无限增殖究其原因在于细胞周期调控紊乱，细胞周期的调控是一个精细复杂的过程，由多种蛋白共同参与。在肺腺癌中，Foxp3对其增殖影响尚不明确，其机制研究更是鲜有报道。因此，本课题拟以人肺腺癌细胞A549为模型，研究Foxp3对肺腺癌细胞增殖周期的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 人肺腺癌细胞系A549为本课题组前期冻存。Foxp3 siRNA购于广州锐博公司。转染试剂Lipofecta mine 2000购于Invitrogen公司。MTT购于Sigma公司。细胞周期试剂盒、anti-Foxp3和anti-CCND1购于天津三箭公司。胶回收试剂盒和DNA抽提试剂盒购于Roche公司。pGL3萤光素酶双报告载体质粒以及双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司。限制性内切酶KpnⅠ、BgⅢ及T4 DNA连接酶购于北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA沉默肺腺癌细胞Foxp3表达 取对数生长期的A549细胞，调浓度2×105ml-1，接种于六孔板(每孔1.5 ml)，次日细胞密度达到60%～70%后进行转染。先分别孵育转染试剂和siRNA，再将两者充分混合，室温孵育20 min。吸弃原六孔板内培养基，换无血清无抗生素DMEM。将上述混合溶液加入六孔板内(siRNA终浓度50 nmol/L)，置于细胞培养箱孵育6 h后，吸弃培养上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。48 h后收细胞提取总RNA，RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达水平。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖 取对数生长期A549细胞，调浓度8×104ml-1，接种于96孔板(每孔100 μl)。沉默Foxp3表达72 h后每孔加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h，弃掉上清后加入100 μl DMSO，低速震荡10 min，使颗粒物充分溶解，于酶标仪波长570 nm测OD值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 沉默A549细胞Foxp3表达48 h后，胰酶消化收取细胞，调浓度1×106ml-1，70%乙醇4℃固定过夜。PBS洗涤2次后加入500 μl PI染液，室温避光孵育30 min后上机检测。

1.2.4 RT-PCR检测细胞周期相关基因的mRNA水平 沉默A549细胞Foxp3表达48 h后，胰酶消化收取细胞，提取总RNA，RT-PCR检测CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA表达水平。

1.2.5 免疫荧光 在24孔板中做细胞爬片，次日取出玻片用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS再清洗3次，0.5% Triton室温打孔20 min，PBS清洗后用1% BSA封闭。加入稀释的一抗，湿盒内4℃过夜。次日加荧光二抗，PBST浸洗3次，湿盒中37℃孵育1 h，再用PBST浸洗3次。滴加DAPI避光孵育1～3 min染核，PBST洗去多余DAPI并吸干液体，封片后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.6 双荧光素酶报告基因 根据http://www.geneco-poeia.com网站提供预测的CCND1可能的启动子作用区，设计引物，为了报告载体构建简便，在引物上下游分别插入限制性内切酶KpnI及BglII，引物由上海生工生物公司合成。上游引物为5′-GCGGTACCTCAGTCCCAGGGCAAATTCT-3′，下游引物为5′-GGCAGATCTAAACTCCCCTGTAGTCCGT-GC-3′，序列大小为1 143 bp。切胶回收PCR产物，在T4 DNA连接酶的作用下行连接反应(16℃过夜)，将连接产物转化感受态大肠杆菌，筛选培养阳性克隆质粒测序鉴定。

沉默A549细胞Foxp3表达24 h后，转染pGL3-CCND1-promoter质粒。48 h后收集细胞裂解物，用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测pGL3-CCND1-promoter质粒的萤光素酶活性。

2 结果

2.1 沉默A549细胞Foxp3表达 为干预A549细胞Foxp3表达，采用RNAi的方法将siRNANC、Foxp3siRNA1和Foxp3siRNA2分别转染A549细胞48h后，RT-PCR法检测各组细胞Foxp3表达。结果显示：siRNA1、siRNA2两组Foxp3表达水平明显低于siRNANC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明:两对siRNA均可特异性干扰Foxp3表达，可以用于后续实验，见图1。

图1 RT-PCR mRNA水平检测Foxp3沉默效果Fig.1 mRNA expression of silencing Foxp3 was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.2Foxp3对A549细胞增殖的影响 为研究Foxp3对A549细胞增殖的影响，沉默Foxp3后采用MTT法检测细胞增殖情况。结果显示：沉默A549细胞Foxp3后，细胞增殖明显减慢，siRNA1、siRNA2两组OD值分别为2.155±0.007、1.786±0.032，明显低于siRNANC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明：Foxp3可以促进A549细胞增殖，见表1、图2。

2.3Foxp3对A549细胞周期的影响 为研究Foxp3对A549细胞周期的影响，沉默Foxp3后采用流式细胞术检测A549细胞的细胞周期。结果显示：沉默A549细胞Foxp3后，细胞发生G0/G1期阻滞，siRNA1、siRNA2两组G0/G1期细胞比例分别为65.6%、64.6%，明显高于siRNANC组50.5%，且S期细胞比例明显低于siRNANC组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明：Foxp3可以促进A549细胞从G1期向S期转化，见图3。

2.4Foxp3对CCND1表达的调控 为研究Foxp3调控CCND1表达过程中的作用机制，首先采用细胞免疫荧光检测A549细胞Foxp3和CCND1的定位情况。结果显示：在A549细胞中，部分区域出现了绿色荧光(代表CCND1表达)及红色荧光(代表Foxp3表达)的重叠区域(黄色区域)，即CCND1与Foxp3的表达出现了共定位。该结果提示Foxp3与CCND1可能直接相互作用，见图4。

GroupsOD570nmsiRNANC2.484±0.104siRNA12.155±0.007siRNA21.786±0.032

图2 MTT检测沉默Foxp3后A549增殖变化Fig.2 Proliferation of A549 after silencing Foxp3 was detected by MTTNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.5 G1/S期checkpoint基因的筛选 为研究Foxp3对A549细胞G1/S期checkpoint基因的影响，沉默Foxp3后采用RT-PCR检测G1/S期checkpoint基因，包括CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6。结果显示：沉默A549细胞Foxp3后，CCND1表达随之降低，明显低于siRNA NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明，Foxp3可以促进A549细胞G1/S期checkpoint基因CCND1表达，见图5。

为进一步验证Foxp3是否对CCND1具有直接调控作用，我们构建了含有CCND1启动子荧光素酶报告基因质粒(pGL3-CCND1-promoter)。重组质粒经双酶切可见大小为1 143 bp的条带，见图6。荧光素酶报告基因检测结果显示：沉默A549细胞Foxp3后，CCND1启动子荧光素酶报告基因活性明显降低(P<0.05)。该结果明确了Foxp3对CCND1的直接调控作用，见图7。

图3 流式细胞术检测沉默Foxp3后A549细胞周期变化Fig.3 Cell cycle of A549 after silencing Foxp3 was detected by FCMNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

图4 A549细胞Foxp3和CCND1的定位表达Fig.4 Expression of CCND1 and Foxp3 on A549 cell by immunofluorescences

图5 RT-PCR检测G1/S期checkpoint基因变化Fig.5 mRNA expression of G1/S cycle checkpoint gene was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

图6 双酶切鉴定pGL3-CCND1-promoter质粒Fig.6 Identification of eukaryotic expression plasmids by restriction endonuclease analysisNote: M.Represents marker;1.Represents pGL3-CCND1-promoter;2.Represents pGL3-CCND1-promoter PCR product after digestion.

图7 双荧光素酶报告基因检测Foxp3对CCND1启动子活性的影响Fig.7 Effect of Foxp3 on activity of CCND1 promoters was detected by dual-luciferase reporter gene assayNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

3 讨论

转录因子Foxp3是Tregs特异的标志物及细胞发育和功能的关键调节基因[9]。一旦Tregs缺失Foxp3，其抑制功能将随之缺失，因此，Foxp3是维持Tregs抑制功能所必需[10]。在肿瘤微环境中，Tregs也发挥着免疫抑制作用，参与了肿瘤免疫逃逸[11,12]，去除Tregs可以诱导抗肿瘤免疫，因此，Tregs是介导肿瘤免疫逃逸的关键细胞。最初人们认为Foxp3仅表达于淋巴细胞，而近年来越来越多的研究发现Foxp3在多种肿瘤组织及细胞中也有表达，高表达Foxp3的肿瘤病人一般预后较差[13,14]。但Foxp3在不同肿瘤中发挥的作用也不尽相同，并且相关机制研究较少。本课题组前期研究发现Foxp3在人非小细胞肺腺癌中高表达，并与淋巴结转移和TNM分期密切相关[15]。因此，本研究以人肺腺癌细胞A549为模型，研究Foxp3在肺腺癌中的作用及相关机制。

肿瘤发生发展的关键之一在于肿瘤细胞的无限增殖，其本质就是细胞周期调控紊乱。本研究结果显示，Foxp3通过促进细胞G1期向S转化从而促进细胞增殖。因此，Foxp3在肺腺癌中发挥促肿瘤细胞生长作用，并与肿瘤细胞周期调控紊乱有密切关系。细胞周期的调控是一个精细的生物学过程，有一个复杂的分子调控网络。细胞周期进程主要由细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)驱动[16]，在G0/G1、G2/M两个关键性限制点进行调控。其中，cyclin和CDK为细胞周期正调控蛋白，CDKI为负调控蛋白。G0/G1期转变标志DNA合成开始，G2/M期转变标志有丝分裂开始，其中G1期向S期转变更为重要。

本研究中我们发现，Foxp3可以促进A549细胞G1/S期checkpoint基因CCND1表达，从而促进细胞从G1期向S期转化。CCND1是细胞周期调控蛋白家族的重要成员，属于细胞周期素cyclin D家族，正向调控G0/G1期限制点，推动细胞从G1期进入S期，开始合成DNA，实现细胞的增殖过程[17]。CCND1的表达、激活、在核内的聚集全都发生在G1中期[18]。CCND1最初被发现于甲状旁腺癌，是一种原癌基因，在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中通过基因扩增、基因重排及突变导致过表达[19-21]。肿瘤细胞CCND1过表达可缩短G1期，促进细胞从G1期向S期转化，加速细胞周期进程，促进细胞分裂，引起细胞周期调控紊乱，导致细胞增殖异常，从而导致肿瘤发生发展[22]。在舌鳞状细胞癌、乳腺癌等肿瘤中，CCND1对于淋巴结转移及预后、提高诊断阳性率均有重要意义[23-25]。但在肺腺癌中，CCND1与肿瘤的发生发展及在肺腺癌中的表达情况一直存在争议[26]。本研究中利用双荧光素酶报告基因实验证实了Foxp3可直接与CCND1启动子结合，促进其转录，引起细胞周期调控紊乱，加速细胞周期进程，最终导致肿瘤细胞无限增殖。这与CCND1在乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌等肿瘤中发挥促癌作用的结果是一致的。但Foxp3与CCND1具体的结合位点还需要进一步研究证实。

基于上述研究结果，我们证实了在人肺腺癌中，肿瘤细胞Foxp3可直接与CCND1启动子结合，促进其转录，引起细胞周期调控紊乱，促进细胞从G1期向S期转化，加速细胞周期进程，导致肿瘤细胞无限增殖促进其发展。以细胞周期调控分子为靶点的肿瘤治疗已成为一个研究热点，Foxp3通过CCND1调控细胞周期影响细胞增殖可为肿瘤治疗提供新思路。

[1] Battaglia M,Stabilini A,Draghici E,etal.Induction of tolerance in type 1 diabetes via both CD4+CD25+T regulatory cells and T regulatory type 1 cells[J].Diabetes,2006,55(6):1571-1580.

[2] 商伟菊,李 岩,梁 婧,等.胃癌患者Th17及Foxp3+调节性T细胞水平检测及临床意义[J].医学与哲学,2012,33(6B):47-49.

[3] Yu-Jie L,Hai-Chao L,Yu-Xiong S,etal.Foxp3 expressed by tongue squamous cell carcinoma cells correlates with clinicopathologic features and overall survival in tongue squamous cell carcinoma patients[J].Oral Oncol,2011,47(7):566-570.

[4] Wang WH,Jiang CL,Yan W,etal.FOXP3 expression and clinical characteristics of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2010,16(43):5502-5509.

[5] Ladoire S,Arnould L,Mignot G,etal.Presence of Foxp3 expression in tumor cells predicts better survival in HER2-over expressing breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Breast Cancer Res Treatment,2011,125(1):65-72.

[6] Ladoire S,Martin F,Ghiringhelli F.Prognostic role of Foxp3+regulatory T cells infiltrating human carcinomas:the paradox of colorectal cancer[J].Cancer Immunol Immunotherapy Cii,2011,60(7):909-918.

[7] 杨佳华,张文杰,吕文杰,等.shRNA-Foxp3对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响[J].中国实用外科杂志,2013,33(1):57-60.

[8] 陈立松,盖晓东,历 春.Foxp3表达对黑色素瘤B16细胞增殖的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2014,15(5):606-609.

[9] Li B,Samanta A,Song X,etal.FOXP3 ensembles in T-cell regulation[J].Immunol Rev,2006,212(1):99-113.

[10] Williams LM,Rudensky AY.Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3[J].Nat Immunol,2007,8(3):277-284.

[11] Mougiakakos D,Choudhury A,Lladser A,etal.regulatory T cells in cancer[J].Adv Cancer Res,2010,107(1):57-117.

[12] Schneider T,Kimpfler S,Warth A,etal.Foxp3+regulatory T cells and natural killer cells distinctly infiltrate primary tumors and draining lymph nodes in pulmonary adenocarcinoma[J].J Thorac Oncol,2011,6(3):432-438.

[13] Winerdal ME,Marits P,Winerdal M,etal.FOXP3 and survival in urinary bladder cancer[J].BJU Int,2011,108(10):1672-1678.

[14] Zeng C,Yao Y,Jie W,etal.Up-regulation of Foxp3 participates in progression of cervical cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2013,62(3):481-487.

[15] Fu HY,Li C,Yang W,etal.FOXP3 and TLR4 protein expression are correlated in non-small cell lung cancer:implications for tumor progression and escape[J].Acta Histochem,2013,115(2):151-157.

[16] 邵荣光.以细胞周期调控分子为靶点的肿瘤治疗[J].中国肿瘤,2005,14(11):8-10.

[17] Wen JM,Huang JF,Hu L,etal.Establishment and characterization of human metastatic hepatocellμlar carcinoma cell line[J].Cancer Genet Cytogen,2002,135(1):91-95.

[18] Masamha CP,Albrecht TR, Wagner EJ.Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma[J].J Hematol Oncol,2016,9(1):30.

[19] Sukov WR,Ketterling RP, Lager DJ,etal.CCND1 rearrangements and cyclin D1 overexpression in renal oncocytomas: frequency, clinicopathologic features, and utility in differentiation from chromophobe renal cell carcinoma[J].Hum Pathol,2009,40(9):1296-1303.

[20] Stahl P,Seeschaaf C, Lebok P,etal.Heterogeneity of amplification of HER2, EGFR, CCND1 and MYC in gastric cancer[J].BMC Gastroenterol,2015,15(2):7.

[21] Burandt E, Grünert M, Lebeau A,etal.Cyclin D1 gene amplification is highly homogeneous in breast cancer[J].Breast Cancer,2016,23(1):111-119.

[22] Davies L,Welch HG.Increasing incidence of thyroid cancer in the United States,1973-2002[J].JAMA,2006,295(18):2164-2167.

[23] Ullah Shah A, Mahjabeen I, Kayani MA.Genetic polymorphisms in cell cycle regulatory genes CCND1 and CDK4 are associated with susceptibility to breast cancer[J].J BUON,2015,20(4):985-993.

[24] 任晓东,牛清华.CCND1、MDM2在乳腺癌中的表达及其对于淋巴结转移和预后的意义[J].中国医疗前沿,2012,7(3):18-20.

[25] 邓 君,饶绍琴,黄文芳.ccnd1基因表达和其它肿瘤标志物在乳腺癌诊断中的应用[J].现代肿瘤医学,2009,17(11):2110-2112.

[26] Rong L,She-Juan A,Zhi-Hong C,etal.Expression of cyclin D1 splice variants is differentially associated with outcome in non-small cell lung cancer patients.[J].Human Pathol,2008,39(12):1792-1801.

[收稿2015-12-15]

(编辑 许四平)

Effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell A549

LIU Ya-Qing,ZHAO Bo,LUO Ya-Dong,LI Yi-Nan，YANG Wei.Department of Immunology,Basic Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To investigate the effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on the proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods: We knocked down the expression of Foxp3 using siRNA.Foxp3 inhibition was detected by RT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Cell cycle of A549 cells were detected by flow cytometry after the transfection of siRNA.Cell cycle-related checkpoint genes were filtered by RT-PCR.The regulation of Foxp3 on cell cycle-related checkpoint genes were detected by immunofluorescence and dual-luciferase reporter assay system.Results: The proliferation of A549 cells were inhibited after silencing Foxp3,and A549 cells were arrested in G0/G1cycle.G1/S cycle checkpoint gene CCND1 was down regulated.Mechanism research show that Foxp3 can regulate the expression of CCND1 directly.Conclusion: Foxp3 can promote the proliferation of A549 cell line by up regulating G1/S cycle checkpoint gene CCND1.This provides a new target for the therapeutic targets of lung adenocarcinoma.

Foxp3;CCND1;Lung adenocarcinoma;Proliferation;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.009

刘亚庆(1990年-)，女，硕士，主要从事肿瘤免疫学研究，E-mail：yqliu13@jlu.edu.cn。

及指导教师：李祎南(1988年-)，女，博士，主要从事肿瘤免疫研究，E-mail：liyn13@mails.jlu.edu.cn。 杨 巍(1980年-)，女，博士，副教授，主要从事免疫耐受方面的研究，E-mail:ywei@jlu.edu.cn。

R730.3

A

1000-484X(2016)04-0490-05