MicroRNA-199a/b-3p抑制三阴乳腺癌细胞增殖机制研究①

王子航 王志成 张嘉星 范运达 康劲松 米旭光

(吉林大学临床医学院，长春130021)



MicroRNA-199a/b-3p抑制三阴乳腺癌细胞增殖机制研究①

王子航②王志成 张嘉星 范运达 康劲松③米旭光④

(吉林大学临床医学院，长春130021)

目的：探讨microRNA-199a/b-3p(miR199)抑制三阴乳腺癌细胞增殖存活的作用机制。方法：在三阴乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-231转染miR199，荧光定量检测miR199表达量；MTT法检测转染miR199对三阴乳腺癌细胞存活率的影响；细胞周期分析检测，转染miR199对在乳腺癌细胞细胞周期的影响。结果：超表达miR199后，三阴乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-231的增殖率分别下降(41.02±2.34)%和(28.42±6.70)%，细胞周期均被阻滞在G1期。结论：miR-199a/b-3p抑制三阴乳腺癌增殖，具有抗三阴乳腺癌增殖药物开发的潜质。

三阴乳腺癌；microRNA-199a/b-3p；增殖

自1991～2010年间，乳腺癌死亡率增长了32.89%，成为死亡率增长最快的癌症，其发病率位居大城市女性肿瘤的第一位[1]。近年来，我国乳腺癌发病率的增长速度已高出原高发国家1～2个百分点，且呈明显的年轻化趋势，每年有16.9万妇女患乳腺癌[2]。根据乳腺癌分子分型，三阴乳腺癌为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER2)均为阴性表达的乳腺恶性肿瘤，约占所有乳腺癌病理类型的10%～17%[3]，相对非三阴乳腺癌，三阴性乳腺癌无分子治疗靶点，内分泌治疗无效；恶性度高，应用化疗药物治疗则敏感率低、副作用大，且预后差，易复发和转移[4]。因此需找新的治疗靶点和手段是三阴乳腺癌研究中的热点，本研究拟通过外源转入microRNA-199a/b-3p对三阴性乳腺癌增殖进行抑制，以达到抗癌的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养相关材料 三阴乳腺癌BT549、MDA-MB-231细胞，使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中国)的DMEM培养基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml，37℃ 5%CO2条件下培养，细胞生长至对数期时传代。

1.1.2 主要实验试剂耗材 microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中国)、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)、Lipofecta-mineTM2000(Life Technologies公司，美国)、MTT(Sigma-Aldrich公司，美国)、SYBR GREEN Master mix(Roche，瑞典)、其他常规试剂(北京化工，中国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的转染(脂质体法) 在转染前24 h，1×106/孔在6孔细胞培养板中接种细胞。转染前将细胞培养液换成不含抗生素不含血清的不完全培养液。将待转染miRNA mimics按说明书加入到250 μl双无培养液中，吹打混匀。同时，将5～10 μl脂质体加入到250 μl双无培养液中，吹打混匀。室温静置5 min后，将两者混匀。室温孵育20 min后，将混合液加入到待转孔中并混匀。培养5 h后，将细胞培养液换成完全培养液。

1.2.2 荧光定量分析 以Trizol法提取细胞RNA，逆转录成cDNA，以SYBR荧光染料定量检测miR-199表达量。根据试剂说明书添加各组分后，95℃预变性30 s，然后40循环的扩增反应(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同时融解曲线分析。结果以2-△△Ct表示mRNA拷贝数比值。

1.2.3 细胞增殖分析 将处于生长对数期的细胞消化成单细胞悬液，以0.5～1×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中。过夜培养后，更换新鲜培养基，每孔100 μl。按转染方法向细胞中加入脂质体-待转染物混合物，每组设三个复孔，同时设对照组，5 h后更换培养基。培养48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(MTT浓度为5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培养4 h后，移除培养液，每孔加入100 μl DMSO，水平振荡10 min，放入酶标仪中检测波长570nm处的光吸收值。代入下述公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(实验组吸光值-空白孔吸光值)/(对照组吸光值-空白孔吸光值)×100%。实验独立重复三次后，将各转染组的细胞存活率导入SPSS软件，计算P值。

1.2.4 细胞周期分析 将PBS清洗过的待测细胞收集到15 ml尖底离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃上清液后用70%乙醇重悬细胞，4℃固定24 h。1 000 r/min离心5 min，移除固定液，加入PI染液，重悬细胞。室温避光30 min后用流式细胞仪进行细胞周期分析。

2 结果

2.1 三阴乳腺癌细胞中miR-199a/b-3p表达量分析 在三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞中，miR-199mimcs转染组的miR-199表达量分别是对照组的(22.33±0.86)倍和(24.43±0.91)倍，均显著高于对照组(P<0.01，图1)。

2.2miR-199抑制三阴乳腺癌细胞增殖miR-199mimcs转染24h后，三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞的增殖率分别下降(41.02±2.34)%(图2A)和(28.42±6.70)%(图2B)，均显著低于对照组(P<0.01)。

2.3miR-199诱导三阴乳腺癌细胞G1期阻滞 应用流式细胞术细胞周期分析检测miR-199抑制三阴乳腺癌细胞增殖的机制。三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞中miR-199转染组G0/G1期细胞所占比例为(75.10±3.09)%和(68.61±3.07)%，与对照组(50.58±1.15)%和(46.39±2.81)%相比均显著上升(P<0.05)(图3)，说明转染miR-199可以将三阴乳腺癌细胞阻滞在G1期。

图1 三阴乳腺癌细胞中miR-199表达量分析Fig.1 Expression of miR-199 in TNBC cellsNote: *.P<0.01.

图2 miR-199抑制BT549(A)和MDA-MB-231(B)增殖Fig.2 Proliferation of BT549 and MDA-MB-231 (B) inhibited by miR-199Note: *.P<0.01.

图3 miR-199对BT549(A)和MDA-MB-231(B)细胞周期的影响Fig.3 Cell-cycle(G0/G1,S and G2/M)analysis of BT549 (A)and MDA-MB-231(B) transfected with miR-199Note: *.P<0.05.

3 讨论

我国乳腺癌发病率位居大城市女性肿瘤的第一位，死亡率增长迅速，乳腺癌已成为对妇女健康威胁最大的疾病[5]。现在乳腺癌的治疗药物以蒽环类、紫杉类、诺维本和健择为主导，对于偏晚期乳腺癌新辅助化疗、新辅助内分泌治疗将成为常规治疗方法进入临床[6]。依据乳腺癌基因表达特征，将乳腺癌分为5个亚型：包括导管A型(LuminalA型)，导管B型(LuminalB型)，HER-2过表达型(HER-2+型)，基底细胞样型(Basal-like型)和正常型(Normal-like型)五型[7]。三阴乳腺癌(TNBC)指的是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER-2)表达均为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌类型的10%～17%[8]。内分泌治疗及针对HER-2的分子靶向治疗对于三阴乳腺癌无效，目前治疗中的主要手段为化疗，但预后较差[9]。MicroRNA(miRNA)非编码单链的小分子RNA，具有转录后调节功能，其异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关[10]。因此，miRNA在肿瘤诊断、肿瘤分型、预后判断及基因治疗中的作用越来越受到关注。

在多种肿瘤细胞中，MiR-199a/b-3p呈现低表达，恢复miR-199a/b-3p表达可抑制肿瘤细胞的增殖，转移等[11，12]。因此，本研究拟探究miR-199a/b-3p对三阴乳腺癌增殖的影响及相应机制。在三阴乳腺癌BT549和MDA-MB-231细胞中超表达miR-199a/b-3p后，细胞的增殖明显下降，说明miR-199a/b-3p具有抑制三阴乳腺癌细胞增殖的能力，与其在肝癌、骨肉瘤和肾癌细胞中作用相同[11,13]。细胞周期分析发现超表达miR-199a/b-3p后，BT549和MDA-MB-231细胞中G0/G1期细胞所占比例显著增加，说明miR-199a/b-3p将三阴乳腺癌细胞的细胞周期进程阻滞在G0/G1期，这与其在其他类型肿瘤中的机制相同，相关分子机制可能与miR-199a-3p抑制mTOR、BCAR3、cMET或Brm等蛋白表达相关，但不排除还与抑制其他基因相关。进一步研究miR-199a-3p抑制三阴乳腺癌增殖的分子机制，可为三阴乳腺癌治疗新靶点的发现提供较高的理论基础，并具有一定的临床价值。

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[2] 郑 莹,吴春晓,张敏璐.乳腺癌在中国的流行状况和疾病特征[J].中国癌症杂志,2013,23(8):561-569.

[3] 胡 彦.三阴乳腺癌患者预后生存因素临床分析[J].中外医疗,2015,34(10):67-68.

[4] 曹 静,吕志排,雷冬梅,等.乳腺癌的分子分型与临床病理特征及预后的关系[J].诊断学理论与实践,2013,12(4):466-469.

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[8] 邱正才.三阴乳腺癌的特征及治疗现状[J].吉林医学,2015,36(13):2766-2767.

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[收稿2015-11-28 修回2016-01-27]

(编辑 张晓舟)

Effect of miR-199a/b-3p on cell proliferation of TNBC cells

WANG Zi-Hang,WANG Zhi-Cheng,ZHANG Jia-Xing,FAN Yun-Da,KANG Jin-Song,MI Xu-Guang.Clinical Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To analyze the inhibiting mechanism of microRNA-199a/b-3p(miR-199)on cell proliferation of triple negative breast cancer(TNBC)cells.Methods: Expression of miR199 in BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199a/b-3p was detected by qRT-PCR.The proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199 were analysed by MTT assay.Cell cycle of TNBC cells transfected with miR-199 was detected by Flow Cytometry assay.Results: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells.Comparing with normal control,the proliferation rate were up to(41.02±2.34)% and(28.42±6.70)%,and the cell cycle were arrest at G1 phase.Conclusion: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of TNBC,and may be a promising anti-cancer drug for TNBC.

TNBC;microRNA-199a/b-3p;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.006

①本文受吉林大学“大学生创新创业训练计划”创新训练国家级培育项目(No. 2015791141)、吉林省科技厅青年基金项目(No.20150520047JH)、吉林省卫生计生科研计划(No.2014Z013)资助。

王子航(1994年-)，男，临床医学专业2012级本科，主要从事抗肿瘤机制的研究，E-mail:1456825616@qq.com。

及指导教师：康劲松(1969年-)，男，博士，副教授，主要从事肿瘤病理生理的研究，E-mail:kangjs@jlu.edu.cn。 米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究员，主要从事肿瘤靶向治疗研究，E-mail:mixg699@163.com。

R735.7

A

1000-484X(2016)04-0480-03

②延边大学医学院，延吉 133002。

③吉林大学基础医学院病理生理教研室，长春 130021。

④吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春 130021。