四种中药单体作为肿瘤细胞疫苗佐剂的体外筛选研究

张丽娜 王 爽 刘泽媛 张 丽 李 玲 胡 明 王 斌

(青岛大学医学院病原生物学教研室，青岛266071)



四种中药单体作为肿瘤细胞疫苗佐剂的体外筛选研究

张丽娜 王 爽 刘泽媛 张 丽 李 玲 胡 明 王 斌

(青岛大学医学院病原生物学教研室，青岛266071)

目的：初步从细胞水平检测原花青素、天麻素、黄芩素、芹菜素四种中药单体对抗原提呈细胞RAW264.7和DC2.4的免疫刺激活性，为肿瘤细胞疫苗佐剂筛选和应用提供理论基础。方法：以LPS作为阳性对照，不同种类、不同浓度的中药单体分别刺激RAW264.7和DC2.4细胞系，48 h后用抗体染色，通过流式细胞仪检测两种细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子的表达量。结果：实验结果显示不同种类、不同浓度的中药单体分别刺激RAW264.7和DC2.4细胞后，细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子不同程度表达上调，原花青素和黄芩素在细胞水平具有较强的免疫刺激活性。结论：原花青素、黄芩素是两种具有潜在应用价值的肿瘤细胞疫苗佐剂。

中药单体；原花青素；黄芩素；免疫活性；筛选；佐剂

恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[1-3]。由于肿瘤具有易侵袭转移和复发的生物学特性，使传统的手术、放疗和化疗效果比较局限[3，4]。在肿瘤治疗中，疫苗免疫已经成为一种新兴的防治方法，在患者体内注射肿瘤疫苗，可以达到有效减轻患者病情并防治高危个体癌症复发的效果，由于肿瘤疫苗治疗无明显的毒副作用，使得肿瘤治疗性疫苗成为疫苗研究领域的热点[5-7]。

免疫佐剂通过物理或化学的方式非特异性地与特异性免疫原结合，从而激活先天性免疫应答、增强免疫系统对抗原的提呈作用、延长抗原在机体内的存在时间以及维持抗原对免疫系统的持续激活等[8]，疫苗佐剂对于增强疫苗的免疫效果具有重要作用。近年来佐剂发展非常迅速，越来越多的物质被发现有佐剂作用[8-14]，因此佐剂的迅速发展为肿瘤疫苗的发展提供了更大机遇。

中药有效成分在疫苗佐剂中应用广泛，可与疫苗起协同作用，能影响和调节机体的免疫功能，具有多方面的免疫活性。因其毒副作用小、安全性高、不易产生依赖性等特点，被认为是理想的免疫调节剂，已成为疫苗佐剂研究的一个热点[15-17]。本文从细胞水平分别检测原花青素、天麻素、黄芩素、芹菜素四种中药单体对RAW264.7和DC2.4细胞系的免疫刺激活性，从而为肿瘤细胞疫苗佐剂的研发提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、培养基及药物 RAW264.7细胞系购自中国科学院上海细胞资源中心，DC2.4细胞系由复旦大学王宾教授(医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室)惠赠，分别培养在含有10%胎牛血清(Gibco)的DMEM(HyClone)和RPMI1640(HyClone)培养基中，并常规培养于含有5% CO2的37°C细胞培养箱中；LPS购自Sigma公司；原花青素、天麻素、黄芩素、芹菜素(标准品)购自大连美仑生物技术有限公司。

1.1.2 试剂及仪器 流式抗体PE anti-mouse H-2Kb(MHCⅠ)，PE anti-mouse I-A/I-E(MHCⅡ)，PE anti-mouse CD80，PE anti-mouse CD86均购自Biolegend公司；-86超低温冰箱(SANYO，日本)；细胞培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；冰箱(青岛澳柯玛集团)；OLYMPUS倒置显微镜；Guava Soft流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 使用无菌双蒸水溶解LPS、原花青素和天麻素，用甲醇溶解黄芩素，用DMSO溶解芹菜素，分别将浓度调整为1 mg/ml。采用倍比稀释法将1 mg/ml原花青素用无血清培养基分别稀释成10、20、40、80 μg/ml 4个浓度梯度，将1 mg/ml天麻素用无血清培养基分别稀释成15、30、60、120 μg/ml 4个浓度梯度，将1 mg/ml黄芩素和芹菜素用无血清培养基分别稀释成25、50、100、200 μg/ml 4个浓度梯度，将1 mg/ml的LPS用无血清培养基稀释成 6 μg/ml。制备RAW264.7和DC2.4细胞悬液，调整细胞浓度为1.5×106ml-1，RAW264.7和DC2.4细胞分别铺96孔板，每孔100 μl，24 h后细胞处于对数生长期时弃掉旧培养液，每孔加入100 μl含有10%胎牛血清的培养基。加入20 μl不同种类、不同浓度的中药单体作为药物处理组，加入20 μl 6 μg/ml的LPS作为阳性对照组，加入20 μl含10%胎牛血清的培养基作为阴性对照组，每孔溶液终体积为120 μl，每组均设3个复孔。

1.2.2 四种中药单体对RAW264.7和DC2.4.7细胞免疫刺激活性的检测 上述96孔细胞培养板做好标记之后，置于含有5% CO2的37°C细胞培养箱中培养；细胞加药处理48 h后，细胞用PE anti-mouse H-2Kb(MHCⅠ)，PE anti-mouse I-A/I-E(MHCⅡ)，PE anti-mouse CD80，PE anti-mouse CD86染色( 每100 μl每106个细胞≤1.0 μg)，于4°C避光染色30 min；用PBS清洗一次，弃上清，每孔加300 μl PBS重悬并分别收集于1.5 ml离心管中，用Guava Soft流式细胞仪进行检测。

2 结果

2.1 原花青素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性 与阴性对照相比，80μg/ml的原花青素作用于RAW264.7细胞后，细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ的表达量显著增加，40μg/ml和20μg/ml的原花青素只对CD80的表达量有显著作用，原花青素对RAW264.7细胞MHCⅠ表达没有显著作用；而原花青素作用于DC2.4细胞后，80μg/ml和40μg/ml的原花青素对CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达都有显著作用，10μg/ml的原花青素只对CD86有显著的免疫刺激活性，其他浓度差异不显著，原花青素对两种细胞系的免疫刺激活性随着浓度的增加呈上升趋势，对比数据得出80μg/ml比40μg/ml免疫效果更显著，即筛选出原花青素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性的浓度为80μg/ml(如图1)。

2.2 天麻素对RAW264.7和DC2.4细胞有免疫刺激活性 与阴性对照相比，天麻素作用于RAW264.7细胞后，4个浓度对RAW264.7细胞表面CD86都有相当显著的免疫刺激活性，120μg/ml的天麻素对细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ的表达有显著作用，60μg/ml的天麻素只对CD86、MHCⅠ的表达量有显著作用，但天麻素对RAW264.7细胞MHCⅡ表达并无显著作用；而作用于DC2.4细胞后，120μg/ml的天麻素对MHCⅡ有极显著刺激活性，30μg/ml的天麻素对CD86有极显著刺激活性，15μg/ml的天麻素对CD80、CD86有极显著的免疫刺激活性，其他浓度差异不显著，天麻素的4个浓度对细胞免疫刺激活性没有明显规律，对比数据得出120μg/ml比其他3个浓度激活了更多的细胞表面标志，即天麻素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性的浓度为120μg/ml(如图2)。

2.3 黄芩素对RAW264.7和DC2.4细胞有极强的免疫刺激活性 与阴性对照相比，黄芩素作用于RAW264.7细胞后，200、100和50μg/ml3个浓度对细胞表面CD80、MHCⅠ、MHCⅡ的表达有极显著作用，25μg/ml的黄芩素只对CD80的表达量有极显著作用，黄芩素对RAW264.7细胞CD86表达没有显著作用；而作用于DC2.4细胞后，4个浓度对CD80、MHCⅠ、MHCⅡ表达量都有极显著作用，50μg/ml和25μg/ml的黄芩素对CD86表达没有显著作用，黄芩素对两种细胞系的免疫刺激活性随着浓度的增加呈上升趋势，对比200、100μg/ml激活的细胞表面标志，得出100μg/ml就有极显著的免疫刺激活性，即筛选出黄芩素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性较好的浓度为100μg/ml(如图3)。

2.4 芹菜素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性 与阴性对照相比，芹菜素作用于RAW264.7细胞后，4个浓度对细胞表面CD80、CD86都有极显著的免疫刺激活性，200、100μg/ml的芹菜素对MHCⅠ、MHCⅡ的表达有显著增强作用，其他两个浓度对MHCⅠ、MHCⅡ表达没有显著作用；而芹菜素作用于DC2.4细胞后，4个浓度对细胞表面MHCⅡ表达量都有极显著作用，另外，200、100μg/ml的芹菜素对CD80、MHCⅠ也有显著的免疫刺激活性，25μg/ml的芹菜素对MHCⅠ的表达有显著增强作用，4个浓度对CD86表达没有显著作用，芹菜素对两种细胞系的免疫刺激活性随着浓度的增加基本呈上升趋势，对比数据得出200μg/ml与100μg/ml具有较强的免疫刺激活性，而且200μg/ml的免疫刺激活性更显著，即筛选出芹菜素对RAW264.7和DC2.4细胞有较强的免疫刺激活性的浓度为200μg/ml(如图4)。

图1 原花青素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4细胞Fig.1 Effects of procyanidin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activation Note:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or procyanidin(10，20，40，80 μg/mL) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

图2 天麻素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4细胞Fig.2 Effects of gastrodin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or gastrodin(15，30，60，120 μg/ml) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

图3 黄芩素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4细胞Fig.3 Effects of baicalein and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activation Note:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or baicalein(25，50，100，200 μg/mL) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

图4 芹菜素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4细胞Fig.4 Effects of apigenin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or apigenin(25，50，100，200 μg/ml) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

图5 四种中药单体和LPS刺激RAW264.7细胞和DC2.4细胞Fig.5 Effects of four kinds of Chinese herbal monomer and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS as positive control or four kinds of Chinese herbal monomer for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

2.5 原花青素和黄芩素是具有潜在应用价值的肿瘤细胞疫苗佐剂 根据以上结论得出对两种细胞系都有较强免疫刺激活性的最佳浓度的中药单体分别是80μg/ml的原花青素，120μg/ml的天麻素，100μg/ml的黄芩素和200μg/ml的芹菜素。与阴性对照相比，四种中药作用于RAW264.7细胞后，原花青素对CD80、CD86、MHCⅡ有显著的免疫刺激活性，天麻素对CD80、CD86、MHCⅠ有显著的免疫刺激活性，黄芩素对CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有显著的免疫刺激活性；芹菜素对CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ都有显著的免疫刺激活性；四种中药作用于DC2.4细胞后，原花青素对CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ四种细胞表面标志都有极其显著的免疫刺激活性，天麻素只对MHCⅡ有极其显著的免疫刺激活性，黄芩素对CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有极其显著的免疫刺激活性，芹菜素对CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有极其显著的免疫刺激活性，即四种中药天麻素的免疫刺激活性最弱。在加药处理及细胞培养过程中，通过显微镜观察，加入芹菜素的细胞培养基中有大量黑褐色斑点，推测可能为芹菜素稀释于DMSO后不溶于培养基，在应用过程中受限。综合以上分析四种中药对RAW264.7细胞和DC2.4细胞的免疫刺激活性，得出原花青素和黄芩素免疫激活效果最好，是两种具有潜在应用价值的肿瘤细胞疫苗佐剂(如图5、6)。

图6 四种中药单体和LPS刺激DC2.4细胞，24 h后观察细胞形态Fig.6 Effects of LPS and four kinds of Chinese herbal monomer on DC2.4 cell line activation,morphology of different groups was observed at 24 h after activation

3 讨论

随着肿瘤发生率的不断增加，各种治疗方法层出不穷，其中免疫治疗能够提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长从而引起了越来越多的关注，多种文献报道疫苗疗法对很多肿瘤均有一定的治疗效果[18-20]。在瘤细胞疫苗治疗中，由于肿瘤特异性抗原表达低下，经常无法有效地诱导抗肿瘤免疫应答，因此在全细胞瘤苗治疗中佐剂是最关键的成份，应用最早、当前应用最广泛的是卡介苗或其衍生物，但引起组织坏死、溃疡等不可避免的副作用，阻碍了其临床应用[21]，因此寻找开发新的、无毒副作用的新型佐剂成为亟待解决的问题。

近年来中药现代化的应用研究成为热点，由于其毒副作用小、安全性高、不易产生依赖性等特点，越来越多的中药被发现有佐剂作用[22,23]。本文以LPS作为阳性对照，不同种类、不同浓度的中药单体刺激RAW264.7和DC2.4细胞系，流式检测细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达量变化;实验结果显示四种中药对RAW264.7和DC2.4细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ不同程度表达上调，原花青素和黄芩素在细胞水平具有较强的免疫刺激活性。本文研究为原花青素、黄芩素作为潜在的肿瘤细胞疫苗佐剂奠定了细胞水平的理论基础，中药原花青素和黄芩素是具有潜在应用价值的肿瘤细胞疫苗佐剂。

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[收稿2015-10-08]

(编辑 张晓舟)

Screening tumor vaccine adjuvants from four kinds of Chinese herbal monomer in vitro

ZHANG Li-Na,WANG Shuang,LIU Ze-Yuan,ZHANG Li,LI Ling,HU Ming,WANG Bin.Lab of Pathogenic Organisms,College of Medicine,Qingdao University,Qingdao 266071,China

Objective:To detect immunological effects of procyanidin,gastrodin,baicalein and apigenin on antigen presenting cells of RAW264.7 and DC2.4 and search for new tumor vaccine adjuvant.Methods: After different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomer and LPS were used to stimulate RAW264.7 or DC2.4 cells for 48 hours,cells were obtained and stained with CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ antibody.Then protein expression levels of CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ on RAW264.7 and DC2.4 cells were analyzed by flow cytometry.Results: Results showed that after 48 hours stimulated with different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomer on RAW264.7 or DC2.4 cells,the expression levels of CD80,CD86,MHCⅠ,MHCⅡ were all up-regulated in comparison with control,procyanidin and baicalein exhibited stronger immunological stimulating activity on a cellular level.Conclusion: Procyanidin and baicalein were found having potential application value in clinical treatment as tumor vaccine adjuvants.

Chinese herbal monomers;Procyanidin；Baicalein；Immunological effects;Screening;Adjuvant

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.012

张丽娜(1989年-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫学研究，E-mail：zhanglina0412@126.com。

及指导教师：王 斌(1962年-)，男，医学博士，教授，博士生导师，泰山学者，主要从事分子病毒学与基因工程药物的研究，E-mail：wangbin532@126.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0504-05