大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及诱导分化

徐威　贝朝涌　粟谋　陈宁　蒋林彬

[摘要] 目的 观察全骨髓贴壁培养法培养骨髓基质干细胞的效果。 方法 将4周龄健康SD大鼠脱颈处死后，无菌条件下取出股骨和胫骨，收集骨髓腔细胞悬液，L-DMEM培养基培养，通过全骨髓贴壁培养法将细胞纯化传代，观察其生长特性，绘制生长曲线。流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD45、CD90并作同型对照，细胞分别向成骨、成脂方向诱导分化，观察诱导结果。 结果 经全骨髓贴壁培养法培养的SD大鼠BMSCs呈集落状贴壁生长，镜下可见细胞成簇生长，类似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。BMSCs增殖速度快，细胞形态稳定，生长状态较好。生长曲线显示BMSCs符合正常细胞生长特征且生长活跃。流式细胞仪鉴定CD29和CD90呈阳性表达，CD45呈阴性表达。BMSCs能向成骨、成脂方向诱导分化。 结论 全骨髓贴壁培养法简单易行，可获得纯度高，活性好，性状均一的骨髓基质干细胞。

[关键词] 骨髓基质干细胞；分离纯化；培养；分化；鉴定

[中图分类号] R414.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）32-0030-05

[Abstract] Objective To observe the effect of BMSCs through the method of whole bone marrow adherent culture. Methods After 4-weeks-old healthy SD rats were killed by cervical dislocation， the femur bone and tibia bone were taken out under sterile conditions. Marrow cell suspensions were collected then cultured in L-DMEM medium. The method of the whole bone marrow adherent culture was used to passage purified. The growth characteristic was observed and the growth curve was drawn. CD29， CD45， CD90 of the cell surface markers were detected by flow cytometry and made an isotype control. The cells could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction respectively and the results were observed. Results Cultured by the method of the bone marrow adherent， the BMSCs of SD rat showed colony adherent growth and other sharp like cell clusters， similar fish，daisy-like petals or whirlpool under microscope. BMSCs had high rate of proliferation， stabilization of morphology and good growth condition. BMSCs showed the growth characteristics of normal cells and actively growing in the growth curve. The expression of CD29 and CD90 were identified positive by flow cytometry. The expression of CD45 showed negative. BMSCs could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction， respectively. Conclusion The method of whole bone marrow adherent culture is simple and can get bone marrow stromal cells of high purity， activity， and homogeneous traits.

[Key words] Bone marrow stromal cells； Isolated and purified； Culture； Differentiation； Identification

1976年Friedenstein等[1-4]从骨髓中分离出骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），并发现该细胞能在体外大量增殖，贴壁呈集落样生长，并且具有定向分化的能力。因其取材简便，克服了部分伦理道德和免疫排斥等问题[5，6]，因此受到人们的广泛关注。由于BMSCs无特异性的表面抗原表型，因此对BMSCs进行分离、提纯、鉴定存在一定的难度。目前，主要有全骨髓贴壁培养法、流式细胞仪分选法、密度梯度离心法和免疫磁珠分选法获得BMSCs。尽管目前有很多种方法能从骨髓中分离获取BMSCs，但是仍没有一个最佳的培养方案[7-9]。本研究尝试全骨髓贴壁培养法体外培养SD大鼠骨髓基质干细胞，观察其生物学特性，鉴定细胞表型，并定向诱导其分化成骨、成脂，以期获得一种生长状态良好，纯度高，生物学性状稳定的大鼠骨髓基质干细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

4龄SD大鼠10只（SPF级），雌雄不限。体重约120 g/只。购于广西医科大学动物实验中心。合格证号：SCXK（桂）2009-0002。DMEM-LG培养基，新生胎牛血清（美国Hyclone公司）。0.25% EDTA-胰酶（上海生工生物工程技术有限公司）。噻唑蓝（MTT）青-链霉素（双抗），二甲基亚砜（DMSO）（北京赛莱博科技发展有限公司）。Anti-Mouse/Rat CD29 （Integrin beta 1） FITC，Anti-Rat CD45 PE，Anti-rat CD90 FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Mouse IgG1 K Isotype Control PE（ebioscience公司）。成骨诱导分化培养基，成脂诱导分化培养基，茜素红溶液，油红O溶液（cyagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究时间 2012年9月～2013年4月。

1.2.2 实验细胞取材 处死大鼠后，放入75%酒精浸泡约10 min，无菌条件下取出股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪开两侧骨端，DMEM低糖培养液冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，并置入70 mm细胞培养皿内，加入适量完全培养基，放置于 37℃、5% CO2恒温培养箱内培养。

1.2.3 大鼠BMSCs培养及传代 上述骨髓细胞悬液培养3 d后首次换液，以后每2天换液一次，以去除未贴壁细胞。当贴壁细胞达80%～90%融合时，去除培养液，胰蛋白酶消化。1000 rpm/min离心5 min，按照1∶2比例传代，每2天换液一次，直至细胞融合至80%～90%，再进行消化传代。

1.2.4 大鼠BMSCs细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察细胞形态，镜检拍照。

1.2.5 大鼠BMSCs生长曲线绘制（MTT法） 以1×104/cm2接种处于对数生长期的P7代BMSCs于96孔板。每孔加入200 μL完全培养液置于37℃、5% CO2孵箱中培养，隔天换液1次。从种板第2天起每天取一板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃、5% CO2孵箱中培养4 h后终止培养。弃除孔中培养液。每孔加入150 μL DMSO溶液，置于摇床上缓慢摇匀10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪测定，选择490 nm波长，测各孔吸光度值。以时间为横坐标，吸光度均值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.6 大鼠BMSCs流式细胞仪细胞表型鉴定 胰蛋白酶消化P7代大鼠BMSCs，PBS液终止消化，短时低速离心2～3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。计数细胞：以106个/管的细胞数分别加入A、B、C、D、E共5个EP管。A管加入2 μL CD29-FITC，B管加入1.25 μL CD45-PE，C管加入1.25 μL CD90-PE，D管加入2 μL CD29同型-FITC，E管加入1.25 μL同型-PE。4℃冰箱避光孵育30 min。PBS液洗涤1～3次，以200 μL PBS液重悬细胞后，细胞筛过滤，移入上样管，流式细胞仪检测表面标记CD29、CD45、CD90表达情况。

1.2.7 成骨诱导 选择P5代SD大鼠BMSCs，待细胞达到80%～90%融合时，消化。将干细胞接种于干燥的明胶溶液六孔板中，每孔约3×103个细胞，加入2 mL/孔干细胞完全培养液。放入37°C，5% CO2孵箱中培养24 h后，移除培养液，加入2 mL/孔成骨诱导液。每3天换液，诱导3周后进行茜素红染色。对照组加入等量完全培养基，相同条件下培养进行茜素红染色。倒置相差显微镜下观察两组结果并拍照。

1.2.8 大鼠BMSCs成脂诱导 选择P5代SD大鼠BMSCs，0.25%胰酶消化接种于六孔板中，每孔约2.0×104个，加入2 mL完全培养液置于37°C，5%CO2孵箱中培养。每3天更换细胞完全培养液，直至细胞生长达到100%融合。移除培养液，每孔加入2 mL成脂诱导液A，3 d后更换成成脂诱导液B进行维持培养，24 h后更换成成脂诱导液A再次诱导，重复3～5个循环。当脂滴出现较多，但形态较小时，改用成脂诱导液B进行维持7 d，脂滴增大时，行油红O染色。对照组加入等量的完全培养基，相同条件下培养进行油红O染色。倒置相差显微镜下观察两组结果并拍照。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs生长及形态观察

经体外培养的大鼠P0代BMSCs 24 h后部分细胞开始贴壁，48～72 h贴壁细胞在皿底伸展开，呈短梭形；1～2 d后细胞形态呈多边形，细胞呈集落状生长。P0代细胞增殖速度较慢，约5～7 d后细胞集落汇合达80%以上，并快速开始增值，细胞形态以梭形为主，较一致。倒置相差显微镜下观察可见细胞成簇生长，类似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。全骨髓贴壁培养法培养的SD大鼠BMSCs能稳定增殖10代以上。P1～P5代BMSCs增殖速度较快，细胞生长状态好，形态稳定。其后逐渐减慢，P10代之后细胞形态明显老化，细胞包体变大，边缘粗糙，形状不规则。见封三图9。

2.2 MTT法绘制大鼠BMSCs生长曲线

SD大鼠BMSCs在接种于6孔板后1～ 2 d，细胞生长曲线低平，吸光值变化不大，为细胞潜伏适应期。随后的第3～8天见细胞生长曲线呈“J”型，说明该时间段细胞处于对数生长期。第8天后细胞增殖减慢明显，曲线变得平缓，进入平台期。见图1。

2.3 大鼠BMSCs流式细胞仪进行细胞CD29、CD45、CD90表型鉴定结果

本实验取CD29、CD45、CD90及其同型抗体，流式细胞仪进行细胞表型鉴定，结果表明，全骨髓贴壁培养法培养的第7代SD大鼠BMSCs表达CD29，CD90，阳性率为90.4%，81.2%；而不表达CD45，阳性率为0.6%。同型-FITC表达率为0.4%，同型-PE表达率为0.4%，说明本实验培养的细胞符合大鼠BMSCs的表型特征。见图2。

2.4 大鼠BMSCs成骨诱导结果

将成骨诱导液培养诱导21 d的SD大鼠BMSCs和普通完全培养液培养诱导21 d的SD大鼠BMSCs同时行茜素红染色后，放置于倒置相差显微镜下观察。倒置相差显微镜下可见诱导培养组出现明显染色的钙结节，而对照组未见钙结节。说明本实验诱导培养的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。见封三图10。

2.5 大鼠BMSCs成脂诱导结果

将成脂诱导液诱导培养5个周期的SD大鼠BMSCs和普通完全培养液诱导培养的SD大鼠BMSCs同时进行油红O染色后，放置于倒置相差显微镜下观察结果。倒置相差显微镜下可见诱导培养组出现染色明显的脂滴，而对照组未见明显的脂滴。说明本实验诱导培养的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。见封三图11。

3 讨论

3.1 BMSCs的体外分离与培养

全骨髓贴壁培养法是应用最早的纯化、分离BMSCs的方法。由Luria 等[10]首先发现BMSCs贴壁生长的特性，并发明了这种纯化、分离BMSCs的培养方法。全骨髓贴壁培养法根据BMSCs在培养皿中贴壁生长，而造血系细胞在培养皿中悬浮生长的特性区别，通过定期更换培养液，去除悬浮细胞和细胞碎片，收集贴壁生长的BMSCs的方法。

该培养法所抽取的骨髓不经过过滤也不离心，骨髓中丰富的生长因子得以保存，这些生长因子能促进BMSCs的增殖。其操作简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，节省实验费用，且分离的BMSCs贴壁时间短，增殖周期短，细胞数量较多，经多次传代后能够逐步纯化，是获取分离BMSCs的成本低廉的简单有效方法[11-13]。

本实验应用全骨髓贴壁培养法纯化和分离SD大鼠骨髓基质干细胞，经体外培养的大鼠P0代BMSCs 24～48 h左右部分细胞开始贴壁，48～72 h贴壁细胞在皿底伸展开，呈短梭形；1～2 d后细胞呈集落状生长，部分细胞呈多边形，细胞形态主要为成纤维样细胞。传代细胞12 h左右能稳定贴壁，并快速开始增值，细胞形态以梭形为主，较一致，倒置相差显微镜下观察可见细胞成簇生长，类似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。约2～5 d长满瓶底。全骨髓贴壁培养法培养的SD大鼠BMSCs能稳定增殖10代以上。细胞增殖速度快，细胞生长状态良好，细胞形态均一稳定。SD大鼠BMSCs在接种于6孔板后1～2 d为细胞潜伏适应期，随后的第3～8天见细胞生长曲线呈“J”型，说明该时间段细胞处于对数生长期。第8天后细胞增殖减慢明显，曲线变得平缓，进入平台期。从细胞增殖传代能力和形态学上观察该法可获得生长状态良好，高纯度的SD大鼠BMSCs。

3.2 BMSCs的表型鉴定

迄今为止BMSCs表面抗原具有非专一性，BMSCs表面未发现特异性抗原表型。BMSCs表达CD105、CD73、CD90、CD29等。BMSCs不表达HLA-DR，即主要组织相容性复合物分子，不表达HLA-Ⅱ抗原、MHC-Ⅱ分子、B7-1、B7-2、CD11a、CD40和Fas L，不表达或极低水平表达HLA-Ⅰ抗原、MHC-Ⅰ分子。BMSCs也不表达造血细胞表面阳性标志，例如CD14、CD34、CD45等[14]，BMSCs具有低免疫原性、诱导免疫耐受和免疫抑制的作用。目前，对BMSCs的研究仍处于探索阶段，还没有理想的、用于鉴定的标志性分子或方法[15-17]。2006年，国际细胞治疗协会确定BMSCs的鉴定标准为：①从骨髓中提取，在塑料培养皿内贴壁生长，在含血清的培养基内高度增殖。②表达CD105、CD73、CD90，不表达CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19；③在体外可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。并非某个或某几个表面标记符合干细胞的特性就能证明该细胞是BMSCs。一般是通过BMSCs的细胞形态、表型及功能来综合鉴定。

本实验取CD29、CD45、CD90及其同型抗体，用流式细胞仪进行细胞表型鉴定，结果显示，该法培养的P7代SD大鼠BMSCs表达CD29，CD90，阳性率分别为90.4%，81.2%；而不表达CD45，阳性率为0.6%。同型-FITC表达率为0.4%，同型-PE表达率为0.4%，说明本实验诱导培养的细胞符合大鼠BMSCs的表型特征。

3.3 BMSCs的多向分化潜能鉴定

BMSCs具有很强的多向分化以及自我更新潜能，且经多次传代后，这些细胞还能保持多向分化潜能。最近的研究表明BMSCs可在体内、体外诱导分化成为各族中胚层组织来源的细胞[18-22]。

本实验将成骨诱导液培养诱导的SD大鼠BMSCs行茜素红染色后，放置于倒置相差显微镜下观察结果，倒置相差显微镜下可见染色明显的钙结节，而对照组未见钙结节。说明本实验培养诱导的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。将成脂诱导液培养诱导的SD大鼠BMSCs行油红O染色后，放置于倒置相差显微镜下观察结果。倒置相差显微镜下可见明显染色的脂滴，而对照组未见明显的脂滴。说明本实验培养的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。

综上所述，全骨髓贴壁培养法培养出的BMSCs为生长状态良好，纯度高，且分化及增殖能力强的BMSCs。

[参考文献]

[1] Friedenstein AJ，Gorskaja JF，Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J]. Experimental Hematology，1976，4（5）：267-274.

[2] Sarraf CE，Otto WR，Eastwood M. In vitro mesenchymal stem cell differentiation after mechanical stimulation[J]. Cell Prolif，2011，44（1）：99-108.

[3] 刘伟，赵劲民，苏伟，等. 骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011，15（32）：6021-6026.

[4] Kentaro Akiyama，Yong-Ouk You，Takayoshi Yamaz，et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cellsin suspension[J]. Stem Cell Research Therapy，2012，3（40）：546-558.

[5] 孙丽，于丽，张华芳，等. 人脐带血间充质干细胞的分离培养及生物学特性[J]. 解剖科学进展，2011，17（2）：131-134.

[6] 杨国宏，张春军，赵富生，等. 骨髓基质干细胞的研究进展[J]. 解剖科学进展，2015，21（4）：412-414，418.

[7] 王艳，胡翰青，邢红艳，等. 小鼠骨髓干细胞的分离培养鉴定及诱导分化的研究[J]. 西南国防医药，2013，41（1）：8-11.

[8] 赵富生，武庚，武杨，等. 不同年龄段大鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2010，14（49）：9147-9150.

[9] Maharlooei MK，Bagheri M，Solhjou Z，et al. Adipose tissue derived mesenchymal stem cell（AD-MSC） promotes skin wound healing indiabetic rats[J]. Diabetes Res Clin Pract，2011，93（2）：228-234.

[10] Luria EA，Owen ME，Friedenstein AJ，et al. Bone formation in organ cultures of bone marrow[J]. Cell and tissue Research，1987，248（2）：449-454.

[11] Ning L，Goossens E，Geens M，et al. Mouse spermatogonial stem cells btain morphologic and functional characteristics of hematopoietic cells in vivo[J]. Hum Reprod，2010，25（12）：3101-3109.

[12] Quan RF，Tang YH，Huang ZM，et al. Difference of adherence，proliferation and osteogenesis of mesenchymal stem cells culturedon different HA/ZrO2 composites[J]. Chin J Traumatol，2012，15（3）：131-139.

[13] 何玉祥，孙岩，刘振川，等. 大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究[J]. 解放军医药杂志，2014， 26（5）：10-13.

[14] 丁冬，梁军，张际绯. 颅骨来源骨髓基质干细胞的分离培养方法[J]. 中国组织工程研究，2014，18（32）：5103-5107.

[15] Maurer MH. Proteomic definitions of mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells Int，2011，2011：1-9.

[16] Li G，Chan CY，Wang H，et al. Proteomic analysis of human mesenchymal stem cells[J]. Methods Mol Biol，2011， 698：443-457.

[17] Yang Z，Schmitt JF，Lee EH. Immunohistochemical analysis of human mesenchymal stem cells differentiating into chondrogenic，osteogenic，and adipogenic lineages[J]. Methods Mol Biol，2011，698：353-366.

[18] 吴丹，单伟，秦书俭，等. 大鼠ADSCs的生物学特性及成骨细胞分化的实验研究[J]. 解剖科学进展，2014，20（5）：401-403.

[19] Garcia-Gomez I，Elvira G，Zapata AG，et al. Mesenchymal stem cells：Biological properties and clinical applications[J]. Expert Opin Biol Ther，2010，10（10）：1453-1468.

[20] Martin TJ. Bone biology and anabolic therapies for bone：Current status and future prospects[J]. Bone Metab，2014， 21（1）：8-20.

[21] OBrien CA，Nakashima T，Takayanagi H. Osteocyte control of osteoclastogenesis[J]. Bone，2013，54（2）：258-263.

[22] Rossini M，Gatti D，Adami S. Involvement of WNT/ beta-catenin signaling in the treatment of osteoporosis[J]. Calcif Tissue Int，2013，93（2）：121-132.

（收稿日期：2015-08-27）