水磨年糕中微生物的分离纯化与鉴定

陈挺+娄永江+庞林江等

摘 要：通过对年糕内部和表面的微生物进行分离纯化，并通过形态观察、生化测定的方法来鉴定微生物的组成，结果表明：年糕表面的微生物主要有6种细菌、3种霉菌和2种酵母菌。细菌中4种是芽孢杆菌，分别为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和短芽孢杆菌（Bacillus brevis），2种是非芽孢杆菌，分别为乙酰短杆菌（Brevibacterium acetylicum）和乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）；霉菌分别为米根霉（Rhizopus oryzae）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和米曲霉（Aspergillus oryzae）；酵母菌分别为茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullulans）和白色假丝酵母（Candida albicans）。年糕内部的微生物有巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌和白色假丝酵母，无霉菌。

关键词：年糕；分离纯化；微生物；鉴定

中图分类号 R155 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）19-25-04

Purification and Identification of Microbes in Water Mill Rice Cake

Chen Ting1，2 et al.

（1School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 311300，China；2Jiangbei Science and Technology Bureau，Ningbo 311300，China）

Abstract：Through the morphology observation and the physiological and biochemical of microorganisms which were separated and purified from the interior and the surface of the rice cake，we can get that there were 6 kinds of bacterium（involving 4 kinds of Bacillus which were Bacillus megaterium，Bacillus subtilis，Bacillus cereus and Bacillus brevis，2 kinds of non-Bacillus were Brevibacterium acetylicum and Acinetobacter calcoaceticus），3 kinds of molds（Rhizopus oryzae，Aspergillus oryzae and Aspergillus nidulans），and 2 kinds of Yeast（they were respectively Candida albicans and Trichosporon pullulans）on the surface of rice cake.The inside microorganisms of Rice cake were Bacillus megaterium，Bacillus subtilis，Bacillus brevis and trichosporon pullulans without mold.

Key words：Rice cakes；Separation and purification；Microbes；Identification

年糕是一种历史悠久且地方特色非常浓郁的方便性米制品[1-2]，水分含量高达45%，营养丰富。年糕在其生产过程中极易受到微生物的污染，其原辅料、加工半成品及成品都直接暴露于空气和水中，在成熟后期的切片、晾晒和装袋的过程中很容易受到空气中的微生物的二次污染[3]。因此，即使是真空包装的年糕也会因一些细菌芽孢的存在而发生腐败。本文通过对年糕表面和内部的微生物进行分离纯化及鉴定，并对年糕表面与内部的微生物进行分析比较，探索提高年糕保质期的方法，为企业开发适合年糕的保鲜措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 年糕：宁波市江北慈城庄永大年糕厂提供。蛋白胨：BR，临安木木生物技术有限公司；琼脂：AR，临安木木生物技术有限公司；牛肉膏：BR，杭州百思生物技术有限公司；氯化钠：AR，西陇化工股份有限公司；葡萄糖：AR，西陇化工股份有限公司；硝酸钠：AR，上海振欣试剂厂；磷酸氢二钾：AR，湖州湖试化学试剂有限公司；硫酸镁：AR，西陇化工股份有限公司；硫酸亚铁：AR，西陇化工股份有限公司，等等。

1.1.2 仪器与设备 电热恒温培养箱：DRP-9162，上海森信实验仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅：D-1，北京发恩科贸有限公司；双人单面洁净工作台：SW-CJ-1CU，苏洁净化；气浴恒温振荡器：ZD-85A，金坛市科析仪器有限公司；精密电子天平：JJ300，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；双目生物显微镜：BA210，麦克奥迪实业集团有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物的分离纯化 各取真空包装年糕的表面与内部的年糕25g，磨碎后放入225mL无菌水中，恒温气浴震荡24h，取上清液在培养基上进行稀释平板分离[4]，挑选形态不同的优势菌株的单菌落进行划线分离，纯化培养，经革兰氏染色后用显微镜观察菌株。

1.2.2 微生物的鉴定

1.2.2.1 细菌的鉴定 主要参考《伯杰细菌鉴定手册（第八版）》[5]中的方法。通过对细菌的菌落特征、细胞形态及生理生化实验来鉴定细菌种类。细菌形态观察的主要操作是挑取长势较好的单一菌落进行革兰氏染色、鞭毛染色和芽孢染色，并观察细菌细胞的形状和细菌细胞间的排列方式[6]。生理生化实验主要包括过氧化氢酶的测定、甲基红试验（M.R试验）、乙酰甲基甲醇试验（V.P试验）、淀粉水解试验和糖发酵试验。

1.2.2.2 霉菌的鉴定 参考沈源[7]和俞科伟[6]等的鉴定方法。通过肉眼观察菌落的颜色、表面特征、生长速度等；通过显微镜观察个体细胞的菌丝、子实体、孢子等的形态[8]。

1.2.2.3 酵母菌的鉴定 参考Lodder与Barnit的鉴定方法[9-10]。形态观察主要包括对菌落、细胞形态、子囊孢子、假菌丝、掷孢子等的观察。生理实验主要是糖发酵实验、同化实验、硝酸钾同化实验、类淀粉物质的形成等。

2 结果与分析

2.1 微生物的分离纯化 本试验在年糕表面分离纯化得到6种细菌、3种霉菌和2种酵母菌，分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6；B1、B2、B3；C1、C2。在年糕内部分离纯化得到3种细菌和1种酵母菌，无霉菌，分别编号为D1、D2、D3；E1。

2.2 微生物的鉴定结果

2.2.1 细菌鉴定结果 对年糕表面分离纯化的细菌的菌落特征进行观察，并用显微镜油镜对其经革兰氏染色后观察，结果见表1。由表1可知，A1、A2为非芽孢杆菌，A3、A4、A5、A6为芽孢杆菌。根据进一步观察分析（表1，图1），可以确定A1属于革兰氏阴性球菌和球杆菌部分，对其进行氧化酶实验，表现为阴性，因此确定A1属不动杆菌属，而A1的形态与《伯杰细菌鉴定手册》中不动杆菌属中的乙酸钙不动杆菌种基本一致，因此确定A1为乙酸钙不动杆菌。

表1 细菌菌落特征及显微镜观察结果

[菌株＼& 菌落特征 ＼& 显微镜观察 ＼&表面特征＼&好氧性＼&颜色＼&革兰氏

染色＼&有无

芽孢＼&大小（μm×μm）＼&A1＼&圆形，光滑，

边缘整齐＼&好氧＼&白色＼&G-杆菌＼&无＼&1.1×2.0＼&A2＼&圆形，光滑，有光泽，湿润，边缘整齐＼&好氧＼&灰白色＼&G+杆菌＼&无＼&0.6×0.8＼&A3＼&圆形，光滑，湿润，

边缘规则齿状＼&好氧＼&白色＼&G+杆菌＼&有＼&1.4×2.7＼&A4＼&圆形，表面粗糙，

不规则，似蜡状＼&好氧＼&白色＼&G+杆菌＼&有＼&1.0×3.2＼&A5＼&圆形，光滑，湿润，

边缘为规则齿状＼&好氧＼&乳白色＼&G+杆菌＼&有＼&0.8×2.1＼&A6＼&圆形，表面色暗，

变厚，不透明，

光滑有光泽＼&好氧＼&白色＼&G+杆菌＼&有＼&0.8×1.6＼&]

根据形态观察可以确定A2属于短杆菌属（表1，图2），对其进行鞭毛染色证明该菌有鞭毛，而其过氧化氢酶试验呈阳性，结合《伯杰细菌鉴定手册》，确定A2为短杆菌属未知的种里面的乙酰短杆菌。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-1.tif>图1 A1显微镜观测结果

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-2.tif>

图2 A2显微镜观测结果

观察发现A3、A4、A6的芽孢囊不明显膨大，芽孢主要为椭圆形或柱状，中生到端生，且都为革兰氏阳性菌，因此A3、A4、A6属芽孢杆菌属的群1，而A5的芽孢囊比较膨大，芽孢多数为椭圆形，因此A5属芽孢杆菌属的群2。对这4种细菌进行生理生化试验，结果如表2。由表2可知，A5为短芽孢杆菌，对A3、A4、A6通过美蓝淡染色进行区分，发现A3、A4的原生质中有不着色的颗粒，结合表3确定A3为巨大芽孢杆菌，A4为蜡状芽孢杆菌。对A6进行耐盐性实验，发现A6在7%的NaCl中生长，且可还原硝酸盐成亚硝酸盐，结合表2、图3确定A6为枯草芽孢杆菌，这与胡庆松[11]通过API微生物鉴定系统鉴定的结果类似。

表2 A3、A4、A5、A6芽孢杆菌的生理生化测定结果

[试验

项目＼&过氧化氢酶＼&淀粉

水解＼&M.R

试验＼&V.P

试验＼&糖发酵试验＼&葡萄糖＼&蔗糖＼&麦芽糖＼&A3＼&+＼&+＼&+＼&-＼&+＼&+＼&+＼&A4＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&A5＼&+＼&-＼&/＼&/＼&-＼&-＼&-＼&A6＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&+＼&]

注：+为阳性，-为阴性，/为不确定。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-3-2.tif><＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-3-1.tif>

图3 A6菌落和显微镜观测结果

采用相同方法对年糕内部细菌进行鉴定，结果表明，年糕内部的3种细菌分别为巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

2.2.2 霉菌鉴定结果 对年糕表面的霉菌B1、B2、B3进一步作纯化培养鉴定。B1在察氏培养基上生长迅速，培养4d后菌落直径约为75mm，菌落呈疏松絮状，在显微镜下观察，其假根主要生长在匍匐枝的节间，孢子囊梗生长在匍匐枝的节间上面，而在梗的顶端膨大形成孢子囊，其孢子呈球形、黑褐色（图4）。根据《真菌鉴定手册》[12]和《微生物学实验手册》[13]，确定B1属根霉属；B1在Pfeffer氏液中45℃和37℃时分别表现为不生长和生长，且其菌丝上面有厚垣孢子，因此B1为米根霉。B2在察氏培养基上培养4d后菌落直径14～18mm左右，14d后直径53～60mm左右（图5，6），生长快，开始几天菌落为白色，慢慢变为淡黄色，最终为黄褐色，显微镜下观察其孢子头呈柱形，分生孢子梗大多数为褐色柱形，且梗顶端膨大，呈圆球形。依照国标（GB/T 4789.16-2003）[14]中描述的霉菌的特征，认定B2为曲霉属的构巢曲霉。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-4.tif>图4 B1显微镜观测结果

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-5.tif>

图5 B2显微镜观测结果

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-6-2.tif><＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-6-1.tif>

图6 B2的足细胞

B3在察氏培养基上生长较快，菌落表面为黄绿色颗粒状，背面无色，质地疏松，边缘菌丝为白色，分生孢子头呈放射状，顶囊呈球形，小梗单层，参考《微生物学实验手册》，认定B3为米曲霉。同样方法，在年糕内部成分中，没有分离到霉菌。

2.2.3 酵母菌鉴定结果 年糕表面酵母菌C1、C2的形态特征和生理生化结果如表3。

表3 年糕表面酵母菌形态特征和生理生化鉴定结果

[特征特性＼&参考指标＼&C1＼&C2＼&形态特征＼&菌落＼&圆形，乳白色＼&圆形，乳白色＼&沉淀＼&有＼&有＼&细胞形态＼&圆形或椭圆形＼&圆形＼&醭、环、岛＼&环＼&环＼&无性繁殖方式＼&芽殖＼&芽殖＼&假菌丝＼&有＼&有＼&子囊孢子＼&无＼&无＼&掷孢子＼&无＼&无＼&生理特性＼&发酵

实验＼&葡萄糖发酵＼&+＼&-＼&乳糖＼&-＼&-＼&蔗糖发酵＼&-＼&-＼&麦芽糖发酵＼&-＼&-＼&同化

实验＼&蔗糖同化＼&-＼&+＼&半乳糖同化＼&+＼&+＼&纤维二塘同化＼&-＼&+＼&甘露糖同化＼&+＼&-＼&鼠李糖同化＼&-＼&-＼&可溶性淀粉同化＼&+＼&-＼&纤维二塘同化＼&-＼&-＼&棉子糖同化＼&-＼&+＼&N-乙酰葡萄糖胺同化＼&-＼&-＼&松三糖同化＼&-＼&+＼&山梨醇同化＼&-＼&+＼&卫矛醇同化＼&-＼&-＼&肌醇同化＼&-＼&+＼&赤藓醇同化＼&-＼&+＼&其他实验＼&类淀粉化合物形成＼&-＼&-＼&KNO3同化＼&-＼&+＼&]

由表4可知，C1、C2均为多边芽殖，均无有性繁殖，细胞圆形或椭圆形，C2有真菌丝和节孢子，因此属于丝孢酵母属，C1菌落无色素，有芽细胞和假菌丝，无子囊孢子，因此C1属于假丝酵母属（图7），经生理特性实验结合《微生物学实验手册》和《酵母菌的特征与鉴定手册》[15]可知，C1为白色假丝酵母，C2为茁芽丝孢酵母（图8）。

年糕内部的酵母菌E1的鉴定结果与年糕表面C1的鉴定结果一致，因此E1也是白色假丝酵母。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-7.tif>图7 C1显微镜观测结果

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼8608-8.tif>

图8 C2显微镜观测结果

3 讨论

本文通过对年糕表面和内部的微生物进行分离、纯化、鉴定，结果表明，年糕表面有6种杆菌（乙酸钙不动杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乙酰短杆菌、蜡状芽孢杆菌和短芽孢杆菌）、3种霉菌（米根霉、构巢曲霉和米曲霉）和2种酵母菌（白色假丝酵母和茁芽丝孢酵母）；年糕内部有3种芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短芽孢杆菌）、一种酵母菌（白色假丝酵母）。年糕中的细菌一般是从原料流入，虽然在高温蒸煮过程中能杀灭大部分的微生物，但并不能彻底地杀灭细菌芽孢，这是年糕腐败的主要原因之一；年糕内部的霉菌和酵母菌种类都比表面少，说明生产中工具清洗消毒不彻底及成熟年糕在晾晒过程中其表面被存在于空气中、年糕摊晾器械表面上的微生物污染，最终造成年糕的腐败。由此，建议在年糕的生产过程中，要尽量做到清洁生产，从原材料到产品等各个环节做到全过程管理，灭菌前期注意芽孢杆菌的污染，灭菌后期注意控制好外界微生物的污染，则能大大提高年糕的保质期，达到延长货架期的目的。

参考文献

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[13]周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[14]GB/T 4789.16-2003.食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定[S].

[15]JA 巴尼特，佩恩，亚罗.酵母菌的特征与鉴定手册[M].胡瑞卿，译.青岛：青岛海洋大学出版社，1991. （责编：张宏民）