异常黑胆质调节药和成熟药对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌试验

努尔艾力·麦提尼亚孜，阿依姑丽·买买提明，阿得力江·吾斯曼，德力拜尔，李建军，赛福丁·阿不拉*

(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院 兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000)



异常黑胆质调节药和成熟药对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌试验

努尔艾力·麦提尼亚孜1，阿依姑丽·买买提明1，阿得力江·吾斯曼1，德力拜尔1，李建军2，赛福丁·阿不拉1*

(1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院 兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000)

为研究异常黑胆质调节药和成熟药对奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，分别筛选10味属于异常黑胆质调节药和异常黑胆成熟药，并以乙醇和水为溶媒分别进行提取，通过体外抑菌试验，检测引起奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌的抑菌作用。结果表明，欧烟堇水提物对3种致病菌均具有广谱的抗菌作用，达到中敏，抑菌圈直径为12.60 mm±0.62 mm～10.45 mm±0.33 mm。甘草和欧烟堇醇提物对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直径为18.03 mm±0.60 mm～18.77 mm±0.21 mm。本试验为研究治疗奶牛乳房炎维药制剂及抗菌维药的开发提供科学依据。

奶牛乳房炎；异常黑胆质；病原菌

奶牛乳房炎病例中80%以上是由链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌引起[1]。治疗奶牛乳房炎应用最多的是抗生素类药，但它严重影响了牛奶的品质，人们开始关注用天然药物防治奶牛乳房炎。郭庆等[2]检测8味中药对奶牛乳房炎病原菌体外抗菌活性，其中金银花、连翘乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌浓度均为15.63 mg/mL。Kinde H等[3]选取3种药用植物检测其抗奶牛乳房炎病原菌的效果，其中苍耳醇提物在高浓度时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈达20.5 mm。异常黑胆质是因机体的任何一种体液如果遇到过多的热烧焦后引起的质量和数量的变化而致[4]。黑胆质调节药具有降低过盛的黑胆质、恢复黑胆质的正常状态；黑胆质成熟药具有成熟异常黑胆质，并为异常黑胆质的顺利清除创造必有的条件[5]。研究发现，维吾尔医学临床上常以“异常黑胆质成熟，清除疗法”防治乳腺增生症；且异常黑胆质成熟剂能改善乳腺增生症，使大鼠乳腺组织病理形态学发生改变[6-7]。本研究选取香青兰、破布木实、欧烟堇3味异常黑胆质调节药及牛舌草、猫儿草、甘草、芦根、菊苣子、天山堇菜花、龙葵果7味异常黑胆质成熟药，通过体外抑菌试验，检测各单味药水提物和醇提物对奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果，筛选出对奶牛乳房炎致病菌具有较强抑菌活性的单味药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 欧烟堇(Fumariaofficinalis)，牛舌草(Anchusaitalica)，破布木实(Cordiadichotoma)，香青兰(Dracocephalummoldavica)，猫儿草(Origanummajorana)，甘草(Glycyrrhizauralensis)，芦根(Phragmitescommunis)，菊苣子(Cichoriumintybus)，天山堇菜花(Violatianshanica)，龙葵果(Solanumnigrum)，以上药物购自新疆维吾尔自治区民族医院。

1.1.2 菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌均由新疆畜牧科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 水提物的制备 称取已粉碎过24目筛的药材20 g，经蒸馏水浸泡2 h，在95 ℃条件下1∶15料比蒸馏水回流提取2 h，再经过1∶10的料比蒸馏水回流提取2 h，合并提取液，离心，滤纸过滤，浓缩至1 g/mL，冷却后置于4 ℃冰箱中保藏备用。

1.2.2 醇提物的制备 称取已粉碎过24目筛的药材20 g，经750 mL/L的乙醇浸泡2 h，在85℃条件下1∶10料比乙醇回流提取2 h，再经过1∶8的料比乙醇回流提取2 h，合并提取液，离心，滤纸过滤，浓缩至1 g/mL，冷却后置于4℃冰箱中保藏备用。

1.2.3 供试菌的制备 将菌种接种于平板，置于37 ℃条件下培养18 h后挑取典型的单菌落接种至肉汤中，于37 ℃条件下培养18 h，用平板计数法计数，用无菌生理盐水稀释至105CFU/mL～109CFU/mL备用。

1.2.4 抑菌圈测定 采用琼脂平板打孔法[8]。取灭菌平皿加入50 μL供试菌，然后将45 ℃左右的培养基倒入平皿，使培养基与菌液均匀混合。待培养基凝固后，用直径7 mm的无菌打孔器在琼脂平板上打6个孔，用无菌针头挑出孔内琼脂，每个孔分别加入100 μL不同的药液，每个药物重复3次，以无菌水、750 mL/L乙醇为空白对照组，以庆大霉素为阳性对照组。在37 ℃的恒温条件下，培养18 h～24 h，后测量抑菌圈直径。

1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)的测定 通过打孔法筛选出抑菌作用较强的单味药，采用试管二倍稀释法[9]进行MIC的测定。取1 mL装有灭菌肉汤培养基的试管共12支，第1支试管加入灭菌处理的药液1 mL(药液浓度：0.5 g/mL)，混匀后吸取1 mL放置于第2支试管，以此类推，直到第9支吸取1 mL弃去，第10支只加菌不加药物作为对照管，第11支只加肉汤培养，第12支中加受试药液1 mL，混匀后吸取1 mL弃去，不加细菌，然后取20 μL的供试菌分别加入到前10支试管中，摇匀后放入37 ℃恒温培养箱中，并观察结果。

1.2.6 最低杀菌浓度(MBC)的测定 取所有无菌生长试管中的肉汤50 μL，划线接种于琼脂平板上，在37 ℃的条件下孵育18 h，平板上菌落生长数小于3个对应的最低药物浓度作为MBC。

2 结果

2.1 打孔法试验结果

由表1可知同种药水提物和醇提物对3个菌株抑菌效果有很大差异。10味药对金黄色葡萄球菌的抑菌效果为：甘草醇提物、欧烟堇醇提物为高敏；甘草水提物、龙葵果醇提物、猫儿草水提物、龙葵果水体物、香青兰水提物、欧烟堇水体物为中敏；破布木实水体物为低敏；牛舌草、芦根、菊苣子和天山堇菜花的水体物及醇提物为无抑菌作用。10味药对大肠埃希菌的抑菌效果为：欧烟堇水提物为中敏；香青兰醇提物、欧烟堇醇提物为低敏；其余8味药无抑菌作用。10味药对无乳链球菌的抑菌效果为：甘草醇提物为高敏；甘草水提物、欧烟堇水提物为低敏；牛舌草水提物为低敏；其余7味药无抑菌作用。

表1 10味异常黑胆质调节药及成熟药的抑菌结果(抑菌圈直径/mm)

注:“15 mm～19 mm”表示高敏；“10 mm～14 mm”表示中敏；“<10 mm”表示低敏；“-”表示无抑菌圈。

Note:"15 mm-19 mm" means highly sensitive；"10 mm-14 mm" means moderate sensitive；"<10 mm" means low sensitive；"-" means not detected.

2.2 MIC和MBC测定结果

大部分单味药对3种致病菌均有不同程度的抑菌作用,其中欧烟堇水提物对3种致病菌的MIC为125 mg/mL～250 mg/mL，对大肠埃希菌的MBC为250 mg/mL；甘草水提物及醇提物对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌均有抑菌作用，MIC和MBC分别为62.5 mg/mL～250 mg/mL和125 mg/mL～250 mg/mL；欧烟堇醇提物、猫儿草水提物、龙葵果醇提物对金黄色葡萄球菌的MIC为125 mg/mL～250 mg/mL，MBC为31.25 mg/mL～250 mg/mL。说明上述药物浓度达到250 mg/mL时均能抑制3种致病菌的生长，且能够杀灭3种致病菌,其中欧烟堇水提物对3种致病菌均有较好的抑菌作用(表2)。

表2 MIC和MBC测定结果(mg/mL)

3 讨论

关于天然药物抗奶牛乳房炎病原菌作用机制的研究已经有很多报道。Rakhshandeh H等[11]研究黑种草苜蓿甲醇提取物对奶牛乳房炎病原菌的体内和体外抗菌作用，结果表明，黑种草苜蓿甲醇提取物能够良好的抑制病原微生物的生长，还能诱发疾病的愈合。杨玉艾等[12]提取了黄芪多糖，检测其对奶牛乳房炎病原菌的抑菌效果。试验表明，黄芪多糖对奶牛乳房炎主要致病菌均有不同的抑菌作用，且随多糖浓度增大而抑菌作用增强，对大肠埃希菌、链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小分别为11.05 mm±0.31 mm，8.50 mm±0.71 mm，9.32 mm±0.21 mm。高桂生等分别测定了20味中草药水提物对奶牛隐性乳房炎主要病原菌的体外抗菌效果，结果显示各单味草药对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌均有一定的抗菌活性，尤其是蒲公英、黄连、连翘、穿心莲、黄芩、红花、野菊花等7味中草药的抗菌效果明显[13]。

本次试验探讨了异常黑胆质调节药和异常黑胆质成熟药对奶牛乳房炎致病菌的抗菌作用，分别提取10味药水提物和醇提物，并通过体外抑菌试验进行检测其抗菌活性，从中筛选出了具有抗奶牛乳房炎主要致病菌的单味药提取物。打孔法检测10味药粗提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和无乳链球菌的抑菌作用。结果显示，甘草醇提物和水提物均对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌有良好的抑菌作用，而对大肠埃希菌未检测到抑菌作用。欧烟堇水提物对3种致病菌均有一定的抗菌作用，抑菌圈大小为12.60 mm±0.62bmm～10.45±0.33fmm。所有药物中甘草醇提物、欧烟堇醇提物、龙葵果醇提物、猫儿草水提物、龙葵果水体物、香青兰水提物和破布木实水提物对金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，其中甘草和欧烟堇醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用与庆大霉素的抑菌作用相接近，抑菌圈直径分别为18.77 mm±0.21bmm、18.03 mm±0.60cmm。本试验在同一条件下，检测了10味药的水提物和醇提物对乳房炎病原菌的敏感性，为防治奶牛乳房炎维吾尔药制剂的开发提供理论和参考依据。

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Inhibition Effects of Abnormal Savda Munziq and Mulayyin Medicines on Pathogenic Bacteria of Cow Mastitis in Vitro

NUERAILI Maitiniyazi1, AYIGULI Maimaitiming1, ADELIJIANG Wusiman1, DELIBAIER1,Li Jian-jun2, SAIFUDING-Abula1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China； 2.InstituteofVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAnimalScience,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

To study the Abnormal Savda Munziq and Mulayyin medicine against pathogenic bacteria of cow mastitisinvitro,water extracts and alcoholic extracts were taken from 10 kinds of single herbals.The inhibition effect of different extracts to the main pathogens of cow mastitis (Staphylococcusaureus,EscherichiacoliandStreptococcusagalactiae) were observedinvitro.The results showed that, the water extract ofFumariaofficinalishad broad spectral antibacterial activity on the all kinds of pathogens of cow mastitis,and the sensitivity is moderate, the range of antibacterial diameters was 12.60 mm±0.62 mm-10.45 mm±0.33 mm.The alcoholic extracts ofGlycyrrhizauralensisandFumariaofficinaliswere more effective on the inhibition ofStaphylococcusaureus, the range of antibacterial diameters was 18.03 mm±0.60 mm-18.77 mm±0.21 mm.This study provided a scientific basis for the development of traditional Uighur medicines in the external treatments of the mastitis in dairy cows and antibacterial medicines.

cow mastitis；Abnormal Savda；pathogenic bacteria

2016-05-16

新疆维吾尔自治区科技计划项目(201531130)；新疆维吾尔自治区产学研联合培养研究生示范基地项目(xjaucxy-yjs-20152005)

努尔艾力·麦提尼亚孜(1995-)，男(维吾尔族)，硕士研究生，主要从事临床兽医学研究。*通讯作者

S859.3

A

1007-5038(2016)11-0083-04