老年性聋易感个体血清差异蛋白的筛选△

姜春丽 张延平 刘金伟 于丽玫 张晨彬



·临床研究·

老年性聋易感个体血清差异蛋白的筛选△

姜春丽1张延平1刘金伟1于丽玫2张晨彬3

目的 研究老年性聋(age-related hearing loss,ARHL)易感个体外周血血清蛋白质组表达变化，筛选差异表达蛋白，建立ARHL易感个体血清蛋白指纹图谱诊断模型。方法 选择2015年1～11月年龄大于60岁的非耳科疾病住院患者，对符合条件的78例进行纯音测听及填写问卷调查表，参照声学听阈与年龄关系的统计分布(GB/T 7582-2004/ISO 7029:2000)国家标准将频率特异性听阈转换为Z值(Z值为在给定频率上个体实际听阈与中位听阈的差异)，以Z值大于零者为易感组(52例)，Z值小于零者为非易感组(26例)，应用弱阳离子磁珠加MALDI-TOF MS技术，结合生物资料管理器软件(bio explorer,BE)筛选老年性聋易感个体血清差异表达蛋白并构建诊断模型。结果 得到显著性差异的多肽峰共有9个，分子量分别为4 047.1、2 957.1、4 084.5、4 260.1、2 102.9、1 288、3 276、4 146.2、3 153.4 Da，其中6个上调，3个下调；选用其中2个建模效果最好的差异蛋白峰(分子量为3 276.0、3 153.4 Da)建立老年性聋易感个体血清蛋白指纹图谱诊断模型，经盲法验证，该模型的敏感度和特异度分别为68.18%、66.67%，ROC曲线下面积为0.711 823，对老年性聋易感者与非易感者有一定的识别能力。结论 本研究筛选出了ARHL差异蛋白，建立了首个ARHL易感个体血清蛋白指纹图谱诊断模型，对老年性聋易感者与非易感者有一定的识别能力，为进一步探讨ARHL防治措施提供了数据参考。

老年性聋； 疾病易感性； 蛋白质组学； 质谱技术

老年性聋(presbycusis)或年龄相关性听力损失(age-related hearing loss, ARHL)是指随着年龄的增长逐渐发生的进行性感音神经性听力下降，开始时以高频听力下降为主，逐渐向低频扩展，严重时可导致全聋，是老年人最常见的感觉性损害，也是人生理性老化过程的一种表现。ARHL发病率高，已成为听力残疾的首要因素, 2007年于丽玫等[1]报道全国听力残疾者共2 045.41万,其中老年性聋有1 364.49万,占 66.87%。由于ARHL严重影响老年人的生活质量，因此ARHL的防治已经成为目前听力学领域研究的热点问题。

目前ARHL的发病机制还不完全清楚，但大家公认其发病与多种因素有关，其中大约1/2与环境因素有关，另外1/2与遗传因素有关[2]。尽管随着年龄的增加听觉敏感度逐渐下降，但是纯音听阈的变化在人群中有很大的差异，这种变异可以部分用遗传易感性解释；因此，如何判断ARHL易感个体成为研究者关注的问题。目前有关ARHL易感性研究很多，主要集中在基因水平的研究，不同学者使用同一方法得出的结论并不完全一致，因此，Fransen等[3]提出ARHL可能从本质上是高度多基因化的，可能并不存在某个起主要作用的基因。

由于蛋白质是人体各项生理功能的执行者，基因与氨基酸并非一一对应，因此单纯基因水平的研究很难完全揭示ARHL易感性的奥秘，因此在蛋白质和氨基酸水平进行研究是必要的。蛋白质组学的研究内容包括鉴定蛋白质的表达、结构、功能，蛋白质的存在方式及其相互作用，蛋白质组学的进步提供了筛选差异蛋白的方法，有助于发现疾病的蛋白标志物、建立诊断模型；因此，本研究拟应用蛋白质组学方法探讨ARHL易感性的原因、筛选易感个体，首先通过Z值(Z值为在给定频率上个体实际听阈与中位听阈的差异)计算的方法将对象分为易感组与对照组，然后应用磁珠分离技术和MALDI-TOF/TOF-MS技术筛选ARHL易感个体差异表达蛋白，并利用差异蛋白峰建立易感个体血清蛋白指纹图谱诊断模型，为ARHL易感个体的筛选提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年1月～11月解放军第309医院眼科及耳鼻喉科年龄大于60岁的非耳科疾病住院患者78例为研究对象，纳入标准：①年龄大于60岁；②排除传染病史、中耳炎性疾病史、耳毒性药物应用史、遗传性聋、突发性聋、噪声性聋病史。

所有的受试对象签署知情同意书，实验方案经解放军第309医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法 所有对象均行全身查体、专科检查、纯音测听检查及问卷调查，计算Z值，空腹抽取静脉血，分离血清，-80 ℃保存备用。

1.2.1 Z值的计算方法 使用纯音测听仪(丹麦，Madsen VOYAGER 502型)于听力检查室对每例对象进行纯音测听，检测0.25～8 kHz纯音气导听阈，根据文献[4]报道方法，参照声学听阈与年龄关系的统计分布(GB/T 7582-2004/ISO 7029:2000)国家标准将频率特异性听阈转换为Z值，Z值的计算公式如下：

Hmd,Y=α(Y-18)2

(1)

Su=bu+ 0.445Hmd,Y当阈值 > Hmd,Y

(2)

Sl=bl+ 0.356Hmd,Y当阈值 < Hmd,Y

(3)

Zf=(阈值—Hmd,Y)/ Su当阈值 > Hmd,Y

(4)

Zf=(阈值—Hmd,Y)/ Sl当阈值 < Hmd,Y

(5)

其中Hmd,Y指听阈中值，md,y代表年龄的中位数，Y代表指定年龄，α指男性和女性的系数，可以在GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000(声学 听阈与年龄关系的统计学分布)中查找。参照GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000，得知中值以上的分布为近似标准偏差是Su的高斯分布，中值以下的分布近似标准偏差是Sl的高斯分布。上述参数bu和bl的值可在GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000表2中查找。因ARHL患者主要表现为高频听力下降，所以在计算中多采用Z248(即2、4和8 kHz对应的Z值的平均值即为Z248)[4,5]。按照上述计算公式，当Z值大于0时为老年性聋易感者，Z值小于0时为老年性聋非易感者，将每个研究对象按照Z值从小到大进行排序划分老年性聋非易感组和易感组。

1.2.2 主要仪器及试剂 MALDI-TOF质谱仪(德国Bruker公司)及自带的BioExplorer软件(德国Bruker公司)，磁力架(磁珠分离器)(NCBA)(德国Bruker公司)，磁珠试剂盒(SB-WCX)以及缓冲液体系(德国布鲁克.道尔顿公司)。

1.2.3 血清的采集及处理 采集受试对象空腹外周静脉血约4 ml，用临床离心机以3 000 r/m离心7 min，立即冻存血清样品于-80 ℃冰箱中。自4 ℃冰箱取出磁珠试剂盒，取200 μl 八连排样品管置于孔板上，依次加入10 μl磁珠、95 μl 磁珠结合缓冲液(CB)、10 μl 血清样本，在室温静置5 min，将样品管在磁珠分离器上静置1 min，磁珠富集到管底并贴壁，与悬浮的液体分离，吸去上清液体。将样品放入孔板中，加入100 μl 磁珠清洗液缓冲液(CW)，静置2 min。然后将样品管在磁珠分离器上静置1 min，吸去上清液体。将样品放置于孔板上，加入10 μl磁珠洗脱液(CE)反复吸打十次以上，放置5 min，使磁珠和洗脱液混悬均匀。将样品放于磁珠分离器上，静置1 min ，使磁珠与悬浮液充分分离，将上清液移出到已标记的0.2 ml 样品管，然后进行质谱分析。1.3 血清质谱分析及统计学方法 应用MALDI-TOF仪器进行样品检测，然后再应用生物资料管理器软件(bio explorer,BE)进行数据分析，包括：生物信息学分析、建立模型、统计学分析、聚类分析，采用Fisher、KNN、Linear SVM、RBF 4种统计学算法分别计算易感组与对照组模型验证准确率，然后使用模型验证组血清进行模型的盲法验证，进一步分析模型诊断的敏感度及特异度。

2 结果

2.1 易感组与非易感组的确定及其纯音听阈 根据Z值的正负排列情况，从78例中选出老年性聋易感者52例，非易感者26例。用于建模的50例中，易感组30例(实验组)，非易感组20例(对照组)；其余28例(易感组22例，非易感组6例)用于模型盲法验证。78例患者中男39例，女39例，年龄60～86岁，平均71.23±7.61岁；<70岁者32例，≥70岁者46例；52例易感者中男19例，女33例，平均年龄71.5±7.85岁；26例非易感者中男20例，女6例，平均年龄70.69±7.23岁；两组间年龄和性别均无统计学差异。因GB/T 7582-2004/ISO 7029:2000中明确说明Z值仅适用于70岁以下人群，因此对于本组对象中年龄≥70岁的46例研究对象再使用传统分组方法[6](即主要根据个体的纯音听阈)进行验证。这46例按Z值法计算有30例属于易感个体，16例属于非易感个体，经传统分组方法验证30例易感个体也可归于实验组，16例也可归于对照组。

52例易感组Z值0.32～2.36,26例非易感组Z值-0.02～-2.58。52例老年性聋易感者按听力损失程度分为轻度听力损失31例，中度听力损失20例，重度听力损失1例。52例易感组左、右耳2、4、8 kHz的平均听阈分别为57.11±15.32、57.75±15.08 dB HL，其中30例≥70岁者左、右耳纯音听阈分别为64.72±13.73、66.83±10.94 dB HL；26例非易感组左、右耳2、4、8 kHz的平均听阈分别为32.05±13.12、32.82±11.87 dB HL，其中16例≥70岁者左、右耳平均听阈分别为35.62±14.21、37.39±12.00 dB HL。

2.2 出峰差异显著性统计 建模的50个血清多肽样品共分析出104个峰，其中有任一样品中峰强度高于300 Da的多肽峰个数为40个。应用生物资料管理器软件(bio explorer,BE)对易感组(实验组)与非易感组(对照组)的血清蛋白指纹图谱进行分析对比后得到出峰差异性有统计学意义的有9个(P<0.05)，分子量分别为4 047.1、2 957.1、4 084.5、4 260.1、2 102.9、1 288、3 276、4 146.2、3 153.4 Da，其中6个表达上调，3个表达下调(表1)，9个差异蛋白峰中峰值图较典型的可被关注的多肽峰峰值图有7个。

表1 9个有差异的蛋白峰结果、平均峰面积及表达

2.3 血清蛋白指纹图谱诊断模型建模 选取9个多肽峰中建模效果最好的两个多肽进行血清蛋白指纹图谱诊断模型建模(这两个峰对模型的识别率相对其它多肽峰要高)，其分子量分别为3 276.0、3 153.4 Da，采用Fisher、KNN、Linear SVM、RBF共4种统计学算法分别计算实验组与对照组模型准确率，使用RBF法计算结果模型对实验组的判别准确率可以达到96.67%，对照组的判别准确率可以达到100%(表2)。二维分布图和主成分分析结果见图1、2，可见该模型可以识别两组样本中大部分质谱数据的特性。分别以灵敏度(sensitivity)为纵坐标，特异度(specificity)为横坐标绘制ROC图，得到AUC=0.711823(ROC曲线下面积)，说明本研究所得的诊断模型具有一定的准确性(图3)。

表2 两组4种方法计算的模型验证准确率(%)

2.4 盲法验证结果 将其余28例血清样本进行盲法模型验证，应用Fisher法诊断ARHL的敏感度和特异度分别为50.00%、66.67%，应用KNN诊断ARHL的敏感度和特异度分别为68.18%、50%，应用Linear SVM诊断ARHL的敏感度和特异度分别为68.18%、66.67%，应用RBF诊断ARHL的敏感度和特异度分别为68.18%、33.33%，说明建立的模型对易感者与非易感者有一定的识别能力。

图1 建模样品分布二维图 绿色代表实验组，红色代表对照组，每个圆点分别代表一个样品，横坐标表示在重要蛋白峰(3276.0 Da)上样品的强度，纵坐标表示在重要蛋白峰(3153.4 Da)上样品的强度

图2 建模样品PCA图 绿色代表实验组，红色代表对照组

图3 显著性差异多肽峰的ROC曲线 根据2个差异峰建模ROC图，纵坐标为敏感度，横坐标为特异度

3 讨论

研究易感基因，必须明确易感者，目前国内外的相关研究主要用两种方式来划分ARHL易感者和非易感者，第一种是传统方法[6]，依据个体的纯音测听结果，只要满足年龄大于60岁、双耳渐进性听力下降、排除其他疾病、PTA>25 dB HL即判定为ARHL易感个体，这种方法的优点是简单、实用，因而被大多数学者采纳，但不足之处是未考虑到年龄与性别因素对听力的影响。鉴于此，又有学者研发了第二种方法，即Z值法，2004年Fransen等[5]研究了一种使用Z值来划分ARHL易感性与非易感性的方法，即当Z值>0时为易感者，Z值<0时为非易感者，但这种方法也存在一些问题，在Z值计算过程中需要参考GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000，该标准仅适用于70岁以内的个体，而对于年龄大于70岁的老年人适用性尚不明确。本研究在参考了大量国内外文献的基础上，选取Z值作为易感者与非易感者的分组标准，对于70岁以上老年人计算其Z值时使用的仍是GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000中提供的系数，为了验证分组的准确性，又使用传统方法对70岁以上研究对象进行易感和非易感的重新分组，结果提示传统方法分组与Z值法一致，说明本组70岁以上老年人分组准确，GB/T 7582—2004/ISO 7029：2000中的参数可能也可以用于70岁以上人群。

目前研究蛋白质组学的主要实验技术可以分为三类，一是蛋白提取，二是蛋白分离，三是蛋白鉴定。磁珠是由多种高分子骨架材料与磁性粒相结合而成，其表面积大，吸附能力超强，可以作为蛋白分离和提纯的一种方式。其原理是试剂盒以弱阳性离子交换原理为基础，采用磁珠在高盐低pH溶液中特异性吸附生物样本中的蛋白质多肽，在低盐溶液中释放蛋白多肽分子，从而捕获血清中的蛋白质多肽，可直接用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的分析。该法捕获蛋白质过程中损失的蛋白质较少，具有高收率、高纯、快速等优点，被越来越多的学者在诸多领域中所应用。本文使用弱阳离子磁珠分离和提取蛋白，为后续实验奠定了基础。

蛋白质组学研究技术的核心是质谱技术，MALDI-TOF-MS技术综合了芯片技术和质谱技术的优点，检测蛋白指纹图谱时无需纯化蛋白，灵敏度及准确度较高，可以同时测定多个蛋白质；对样本的要求也较低，可对血清、体液、尿液、细胞裂解液以及唾液进行研究；对样本的量需要也极少，一般情况下只需2 000个细胞或0.5～5 μl血清就足以完成。MALDI-TOF-MS技术检测所需时间极短，只需10秒即可完成一次质谱检测。对于发现疾病生物标志物和研究药物代谢等方面具有重要意义，目前该技术已在卵巢癌、胃癌、乳腺癌[7]、鳞状上皮细胞癌[8]、食管癌[9]、胰腺癌[10]、宫颈癌[11]等疾病的诊断与预后方面得到了广泛的应用，在耳科研究方面也具有较好的应用前景[12～14]。

经典蛋白质组学研究技术2D电泳凝胶不易分辨出分子量小于4 000 Da的蛋白，而MALDI-TOF-MS技术主要研究的是小分子量蛋白，对相对分子量相差1 Da的蛋白也可分辨，对分子量是20 000以内的蛋白质有很好的识辨能力。因分子量为10 000至20 000的峰个数较少，本研究主要关注分子量为10 000以内的峰，识别出的最大分子量是9291.4 Da，其中任一样品中峰强度高于300 Da的多肽峰个数为40个，因此对小分子的蛋白关注度较高。

本研究首次选用弱阳离子磁珠结合MALDI-TOF-MS技术检测ARHL易感者与非易感者血清差异蛋白表达情况，共发现104个差异多肽峰，其中任一样品中峰强度高于300 Da 的多肽峰个数为40个，差异有统计学意义的多肽峰有9个(P<0.05)，其中6个在易感组中上调、3个下调。在9个显著差异多肽峰中选取建模效果最好的M/Z为3 153.4 Da 和3 276.0 Da的两个峰建模(这两个峰对模型的识别率相对其它多肽峰要高)，应用RBF算法计算易感组模型验证准确度为96.67%，对照组模型验证准确度为100.00%，应用Linear SVM盲法验证结果模型的敏感度和特异度分别为68.18%、66.67%，ROC曲线下面积为0.711 823，说明本研究所建立的ARHL诊断模型对易感者与非易感者具有一定的识别能力。

本研究首次建立了老年性聋易感个体血清蛋白指纹图谱诊断模型，为研究ARHL的发病机制和研发筛查试剂盒提供了参考。但还存在一些不足之处，如：模型验证后的敏感度和特异度不高，可能与本研究中正常对照组的例数较少有关，且筛选出的9个显著差异多肽峰均为小分子蛋白，具体结构及功能尚不明确，需进一步深入研究各自的氨基酸排列顺序，明确各肽段对应的蛋白；此外，技术上也可能存在血清样品的多次冻融继而影响质谱图质量。在今后的研究中应加大样本量，更精确地研究ARHL易感个体的易感蛋白，提高诊断的特异度及敏感度。

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4 Fransen E，Van Laer L，Lemkens N，et al. A novel Z-score-based method to analyze candidate genes for age-related hearing impairment[J]. Ear Hear，2004，25：133.

5 Friedman RA，Van Laer L，Huentelman MJ，et al.GRM7 variants confer susceptibility to age-related hearing impairment[J]. Hum Mol Genet，2009，18：785.

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(2016-04-07收稿)

(本文编辑 李翠娥)

The Screening of the Changes of Peripheral Serum Protein Expression in Individuals with Age-related Hearing Loss

Jiang Chunli*, Zhang Yanping, Liu Jinwei, Yu Limen, Zhang Chenbin

(*Department of ENT, the 309th Hospital of PLA,Beijing,100091,China)

Objective In this study, we studied the changes of peripheral serum protein expression in ARHL susceptible individuals. The differentially expressed proteins were screened. The pathogenesis of ARHL was further explored and the susceptible individual screening strategy was studied.Methods Hospitalized patients without ear diseases from January to November 2015 were studied. Pure tone audiometry was conducted(n=78)with the Z score being calculated for each patient. The patients were divided into susceptible group (n=52) and unsusceptible one (n=26) according to the Z scores. MALDI-TOF MS combined with weak cation bead was used to screen the differential protein in the susceptible individuals with ARHL. And then the diagnostic model of serum protein fingerprint of ARHL susceptible individuals was established by BE software.Results Nine polypeptides of statistical significance were found. Their molecular weights were 4 047.1 Da, 2 957.1 Da, 4 084.5 Da, 4 260.1 Da, 2 102.9 Da, 1 288 Da, 3 276 Da, 4 146.2 Da and 3 153.4 Da, respectively. Among these protein peaks, there were 6 up regulated and 3 down regulated, which might become the biomarkers of ARHL susceptible individuals. The diagnostic model of serum protein finger print of ARHL susceptible individuals was established by using 2 differentially expressed proteins of the molecular weights of 3 276.0 Da and 3 153.4 Da. The sensitivity and specificity of the model were 68.18% and 66.67% respectively in double-blind verification test. The area under the ROC curve was 0.711 823.Conclusion The first serum protein fingerprint diagnostic model was established for ARHL susceptible individual. This study also provided

for searching better prophylactic-therapeutic measures of ARHL.

Presbycusis; Disease susceptibility; Proteomics; Mass spectrometry

△ 2013年全军保健专项课题面上项目(13BJZ24)、总参军事医学与老年病科研课题重点项目(ZCWS14B07)、全军医学科学技术研究“十二五”计划项目面上项目(CWS11C171)和北京市自然科学基金面上项目(7142155)联合资助

姜春丽，女，河南人，在读硕士，主要研究方向为聋病防治。

张延平(Email:yzhan28@163.com)；于丽玫(Email:limeiyu@vip.sina.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.006

时间：2016-11-2 16:18

R764.43+6

A

1006-7299(2016)06-0549-05

1 解放军第309医院耳鼻咽喉科(北京 100091)； 2 北京市聋儿康复中心； 3 第四军医大学

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.004.html