重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

林辉煌,刘春凤,尹凤红,丁玉梅,陈清西*

(1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;2.厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361028)

重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

林辉煌1,2,刘春凤2,尹凤红2,丁玉梅1,陈清西1*

(1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361102;2.厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361028)

采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主,通过300 L发酵罐进行中试发酵表达重组人白细胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经溶解、变性、稀释复性及亲和层析捕获,获得融合蛋白;融合蛋白经肠激酶酶切后,再经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤,获得高纯度rhIL-13原液.每升发酵液可获得高纯度的rhIL-13原液约30 mg.通过本纯化工艺获得的rhIL-13原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测,纯度大于98.75%;经高效液相色谱分子排阻(HPLC-SEC)法检测,纯度为100%;质谱(MS)法测定rhIL-13分子质量为12 348 u,与理论值基本一致;采用噻唑蓝(MTT)法进行比活性检测,比活大于8.0×106IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法对rhIL-13二硫键数目和位置进行分析,结果显示二硫键数目和位置与理论一致.此操作方法可获得高纯度、高活性的rhIL-13原液,并且操作简单,易于放大,可实现工业化规模生产.

重组人白细胞介素-13(rhIL-13);表达;纯化;鉴定

白细胞介素-13(IL-13)是一种多功能细胞因子,主要由T细胞、嗜碱粒细胞、浆细胞及树突状细胞等,尤其是Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)在活化状态下分泌产生[1].IL-13的主要功能包括:诱导单核细胞分化,增强主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的表达[2];抑制脂多糖诱导的单核因子分泌,控制炎症反应[3];诱导B细胞增殖及合成IgE类抗体,增强B细胞表面MHCⅡ类分子、CD23及CD72的表达[4];协同IL-2刺激自然杀伤细胞产生干扰素,从而促进单核-巨噬细胞活化和Th1的免疫反应[3].此外,IL-13还能抑制Ⅰ型人类免疫缺陷病素(HIV-1)在巨噬细胞内复制,诱导中性粒细胞中IL-1RA基因表达和蛋白质合成[5].重组人IL-13(rhIL-13)为1条非糖基化的单链多肽,含112个氨基酸残基,2对二硫键,分子质量约为12.3 ku[6].

目前rhIL-13基本上采用基因工程方法获得,通过对其cDNA加入特定标签和引物后进行PCR扩增,插入到质粒中经DNA重组后筛选阳性克隆,转化入感受态细胞中进行发酵表达获得融合蛋白,再通过对融合蛋白酶切和下游纯化获得rhIL-13蛋白[7-9].在操作过程中,工程菌的选择、融合蛋白的复性和纯化工艺等对rhIL-13产率和生物学活性影响较大[7].本研究中采用基因工程技术获得高效表达rhIL-13融合蛋白的表达菌株,进行300 L发酵制备融合蛋白,经变性、复性以及亲和层析、分子筛层析等分离纯化后获得高纯度、高活性的rhIL-13原液.

1 主要材料

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ColdⅡ-IL-13基因工程菌株由厦门大学生命科学学院酶学实验室和厦门特宝生物工程股份有限公司构建并保存;酵母提取物和蛋白胨为Oxoid公司产品,丙烯酰胺为Promega公司产品;Chelating Sepharose Fast Flow (CS)、Superdex 75(S-75)填料为GE公司产品;其他试剂均为国产分析纯.

主要仪器:30和300 L全自动发酵罐,B.Braun Biotech公司;全温振荡器,哈尔滨东明医疗器械厂;离心机,Beckman公司;P2B005A01超滤膜,Millipore公司;Basic 100蛋白纯化仪,GE公司;LC1200高效液相色谱(HPLC)仪,Agilent公司;AutoflexⅢTOF/ TOF串联质谱仪,Bruker公司;DU800紫外-可见光分光光度计,Beckman公司.

2 实验方法

2.1rhIL-13融合蛋白的发酵表达

取rhIL-13工程菌株BL21/pColdⅡ-IL-13,按体积比1∶400接种至100 m L LB培养基,1 L三角瓶, p H 6.0、37℃、200～250 r/min培养至菌液在600 nm处吸光度(OD600)约为1,作为一级种;一级种按体积比1∶200接种至20 L LB培养基,30 L发酵罐,p H 6.0、37℃、200～250 r/min培养至OD600约为10,为二级种.二级种按体积比1∶6接种至120 L LB培养基, 300 L发酵罐,p H 7.0、37℃、溶氧(DO)70%(饱和度)培养至菌液OD600约为5.0;将发酵温度降至15℃,用含40 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的氮源补料液1.5 L,1 h内流加诱导,过程中补加碳源或2 mol/L NaOH以维持p H 7.0,诱导总时长约24 h.发酵完毕后离心收集菌体.

2.2融合蛋白变性与捕获

取发酵获得的菌体50 g,按1 g菌体对应10 m L溶液的比例重悬于500 m L 100 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L盐酸胍、30 mmol/Lβ-巯基乙醇(β-ME)、p H 8.0的缓冲液中,冰水浴维持30 min;用高速冷冻离心机10℃、10 000 r/min离心20 min得上清.

CS层析柱用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L盐酸胍、3 mmol/Lβ-ME、p H 8.0的缓冲液平衡4个柱床体积,再将离心上清液上样;然后用50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L盐酸胍、3 mmol/Lβ-ME、20 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液和50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L盐酸胍、3 mmol/Lβ-ME、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液进行分步洗脱,收集目的样.

2.3融合蛋白复性

捕获的变性蛋白洗脱液按体积比1∶19加入到100 mmol/L Tris-HCl、0.8 mol/L盐酸胍、0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.5 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、p H 8.0的缓冲液中.10℃左右缓慢搅拌复性48 h后,超滤至小体积,再用p H 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)超滤置换以去除盐酸胍、GSH和GSSG,最后收集目的样.

2.4融合蛋白酶切与纯化

将肠激酶(EK)以摩尔比1∶120加入到超滤脱盐后的样品中,混匀后10℃酶切约14 h.

CS层析柱用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、p H 8.0的缓冲液平衡5个柱床体积,酶切后样品上样,依次用30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液,30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液和30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液进行洗脱,并收集各洗脱峰样品.

2.5S-75层析柱精纯

S-75层析柱用p H 7.4的PBS平衡3个柱床体积,取上一步中由30 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑、p H 8.0的缓冲液洗脱所得目的样上样,再用p H 7.4的PBS洗脱收集目标蛋白. 0.22μm滤膜过滤除菌,分装即为rhIL-13原液,-65℃以下冻存.

2.6rhIL-13的纯度检测

高效液相色谱分子排阻(HPLC-SEC)纯度检测:色谱柱为TSK GEL 2000 SWxl排阻柱,规格为直径7.8 mm,柱高300 mm,粒径5μm,孔径12.5 nm,球蛋白分子质量分离范围5～150 ku;样品稀释到0.2 mg/m L,取50μL上样,以0.1 mol/L PBS(p H 7.0)-0.1 mol/L NaCl溶液为流动相,流速0.7 m L/min,柱温为室温,检测波长280 nm.按面积归一化法[10]计算目标峰面积占总峰面积的百分数,得出rhIL-13的HPLC-SEC纯度.

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)纯度检测:取纯化后的蛋白溶液,按质量分数1.25%(250 ng)、2.5%(500 ng)、5%(1μg)、100% (20μg)的上样量进行SDS-PAGE分析.分离胶质量分数16%,电压80～100 V,考马斯亮蓝G250染色.还原型方法步骤同上述非还原型方法,但使用2×还原型上样缓冲液(取1 mol/L二硫苏糖醇(DTT)与2.5 ×非还原型上样缓冲液按体积比1∶4混合).

2.7rhIL-13的理化性质分析

采用Bruker公司REFLEXTMⅢ型基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)仪,测定rhIL-13分子质量;基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸,蛋白分子质量标准品采用Bruker公司的Protein Calibration StandardⅡ,分析软件为flex Analysis ver.3.0.54.0.

利用人红白血病细胞系(TF-1)对rhIL-13具有依赖生长的特性,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对rhIL-13进行比活性测定.标准品购自R&D公司,比活为7.8×105IU/mg.

采用LC1200 HPLC仪和AutoflexⅢTOF/ TOF串联质谱仪进行二硫键分析.先用胰蛋白酶酶切后HPLC收集二硫键连接的肽段,再用α-糜蛋白酶酶切分析二硫键连接方式.

3 表达纯化结果分析

3.1rhIL-13融合蛋白的发酵表达

对发酵过程中不同诱导时间的发酵液进行取样,取相同OD600的菌体,高温破碎,SDS-PAGE检测,结果见图1:rhIL-13融合蛋白表观分子质量约为17 ku (图1中箭头所示),随着诱导时间的延长,发酵的目的产物逐渐增加,获得更多的生物量积累.300 L发酵罐最终获得发酵液约120 L,离心获得约2 kg菌体.

图1　rhIL-13融合蛋白发酵表达过程菌体裂解液的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of lysates of rhIL-13 expressing strain during fermentation

3.2rhIL-13融合蛋白变性与捕获

菌体经裂解和融合蛋白包涵体溶解后,蛋白处于变性状态.发酵表达的融合蛋白N末端带有6个组氨酸标签,可特异性与CS层析填料结合.纯化洗脱图谱见图2(a),图中I号峰为未挂柱的杂蛋白,Ⅱ号峰为上样后预冲洗下来的杂质,Ⅲ号峰为目标蛋白,共250 m L,检测蛋白质量浓度为1.88 mg/m L.Ⅲ号峰对应收集样品的电泳结果见图3中泳道1.

图3　SDS-PAGE法分析纯化过程的rhIL-13样品Fig.3 SDS-PAGE analysis of the samples of rhIL-13 during purification process

图2　rhIL-13的捕获与分离纯化的层析谱图Fig.2 Chromatogram of rhIL-13 during capture and purification process

3.3变性蛋白复性与超滤

Ⅲ号峰经稀释后复性48 h,超滤去除盐酸胍、GSH和GSSG等,同时进行缓冲液替换,最后超滤收样200 m L,检测蛋白质量浓度为1.1 mg/m L,样品电泳结果见图3中泳道2.

3.4融合蛋白的酶切与纯化

按摩尔比120∶1向超滤后样品中加入EK,10℃酶切14 h,酶切后样品电泳见图3中泳道3.

CS层析柱纯化过程如图2(b)所示,3种洗脱液洗脱所得样品(Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ)分别收集,Ⅳ号样品(40 m L,检测蛋白质量浓度为3.1 mg/mL)用于下一步纯化;3个样品分别进行电泳检测,结果见图3中泳道4,5和6.

CS层析柱分离后的Ⅳ号样用S-75层析柱纯化和缓冲液置换,收集目的样,见图2(c),共收集2个峰(Ⅶ和Ⅷ).图3中,泳道7对应Ⅷ号峰样品,泳道8和9均对应Ⅶ号峰样品,其中泳道9样品中添加了DTT.样品用0.22μm滤膜过滤除菌,分装即为rhIL-13原液,-65℃以下冻存.

3.5纯化过程各样品电泳与收率分析

从图3中泳道1可以看出,经变性捕获后,菌体相关蛋白杂质已基本去除,融合蛋白纯度较高;从泳道2可以看出超滤操作对样品电泳纯度基本上没有影响;从泳道3可以看出,融合蛋白酶切较完全;从泳道4,5和6可以看出,酶切后产物被有效分离,主要目的蛋白在Ⅳ号洗脱样中,Ⅴ号和Ⅵ号洗脱样品主要为杂质;从泳道7可以看出,样品经S-75柱纯化后,纯度较高,杂质进一步得到去除;从泳道8和9可以看出,杂质主要是二聚体杂质.

纯化过程各步蛋白收率见表1,由于菌体溶解后样品中含大量菌体蛋白,定量不准,因此未获得数据.从表1可以看出,捕获后到原液总收率为22.6%.

表1　纯化中各步收率Tab.1 The recovery rate of each operation step during purification

4 原液检测分析

4.1rhIL-13原液活性测定

采用TF-1/MTT比色的方法测定rhIL-13的比活性.rhIL-13能促进TF-1细胞增殖,且TF-1细胞的增殖数量与培养体系中rhIL-13含量呈剂量依赖性;MTT在活细胞的线粒体中可以定量地被还原为蓝色的甲臜,通过比色法测定甲臜的量可以直接表示TF-1细胞的生长状态.标准品购自R&D,进行3组平行实验,3次测定的相对标准差(RSD)小于10%.平均比活为9.8×106IU/mg,远大于标准品(7.8×105IU/mg).

4.2SDS-PAGE检测结果

用非还原型和还原型SDS-PAGE法检测纯度.分别上样1.25%(250 ng),2.5%(500 ng),5%(1μg)和100%(20μg),电泳结果见图4:1.25%的目的蛋白条带亮于杂质带,表明rhIL-13的杂质含量低于1.25%,即rhIL-13的电泳纯度大于98.75%.

图4　SDS-PAGE法测定rhIL-13纯度Fig.4 Determination of purity of rhIL-13 by SDS-PAGE

4.3HPLC检测结果

rhIL-13的HPLC-SEC检测结果见图5,从图中可以得知,按面积归一化法计算,检测样品中rhIL-13的峰面积占总面积的100%,即rhIL-13原液的HPLC-SEC纯度为100%.

图5　HPLC-SEC法测定rhIL-13纯度Fig.5 Determination of purity of rhIL-13 by HPLC-SEC

4.4MS检测分子质量

MALDI-TOF MS测定rhIL-13的分子质量,结果显示rhIL-13的分子质量为12 348 u(见图6),与理论分子质量(12 312 u)基本一致.

图6　MALDI-TOF MS法测定rhIL-13分子质量Fig.6 Determination of mass spectrum of rhIL-13 by MALDI-TOF MS

4.5rhIL-13的二硫键分析

rhIL-13分子中含4个半胱氨酸,理论上其第28位的半胱氨酸和第56位的半胱氨酸形成二硫键,第44位的半胱氨酸和第70位的半胱氨酸形成二硫键.

取2份样品(其中1份加DTT处理)分别用胰蛋白酶酶切后,进行肽图比较分析,可得50.7 min样品为含二硫键肽段.将这些肽段用α-糜蛋白酶酶切后肽图得36.2,38.8和43.8 min 3个样品;对MS谱图中这3个峰进行二次解析,在分子质量1 522 u(36.2 min)和2 395 u(43.8 min)的二次图谱中发现二硫键的特征谱图;再分别取36.2和43.8 min的样品进行MS分析,同时与加DTT处理过的样品进行对比,除了分子质量为506 u的肽段较小且得质子能力较弱而未出现在谱图中,其他3个肽段(分子质量分别为1 019,1 077,1 320 u)均出现在谱图中.rhIL-13原液二硫键的连接情况为C28-C56和C44-C70,与理论位置一致,如图7.

图7　rhIL-13的二硫键示意图Fig.7 Diagram of disulfide bonds in rhIL-13

5 讨 论

rhIL-13目前主要通过基因工程方法进行制备,而表达载体和表达菌株各有不同,如:王文等[7]构建了大肠杆菌表达菌株rhIL-13-p GEX-4 T-2/TG1进行GST-IL-13融合蛋白表达,但由于复性时大量目的蛋白的沉淀丢失及残留盐酸胍和原核多肽GST的影响,测得的生物活性并不高;江阳等[8]构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株p PICZαA-IL-13/GS115表达制备IL-13非融合蛋白,其生物学活性达到标准品的要求.

本研究采用大肠杆菌BL21/p ColdⅡ-IL-13表达菌株进行rhIL-13融合蛋白的表达,在15℃低温环境下进行诱导,而低温环境下蛋白质折叠速度影响较小,转录和翻译速度被充分降低,为蛋白质折叠、产生有活性的蛋白和避免非活性蛋白聚合体形成提供了充足的时间,有利于目的蛋白的产生.表达产物融合蛋白携带组氨酸标签和EK酶切位点,可通过亲和层析高效获得高纯度目的蛋白,简化了下游纯化工作.

本纯化方法主要分为3个步骤:1)采用CS亲和层析,捕获带有纯化标签的目标蛋白,快速地与细胞破碎后释放的酶、核酸、菌体蛋白、内毒素以及色素分离,有利于融合蛋白的稳定;2)EK酶切后蛋白用CS亲和层析纯化,利用不同蛋白质氨基酸序列中组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基与固定化金属离子结合能力不同,用不同浓度的咪唑进行蛋白分离,获得高纯度的目标蛋白;3)最后用S-75分子筛进行精细分离,去除少量多聚体杂质,并替换缓冲体系,即得rhIL-13纯品.

采用TF-1细胞增殖法测定rhIL-13活性,比活超过8.0×106IU/mg;SDS-PAGE结果表明,rhIL-13电泳纯度超过98.75%;HPLC-SEC纯度为100%.MS检测rhIL-13分子质量为12 348 u,与理论分子质量12 312 u基本相符;rhIL-13二硫键位置与理论一致,为C28-C56和C44-C702对二硫键.

综上,本研究利用BL 21/p ColdⅡ-IL-13菌株实现了rhIL-13融合蛋白的高效表达,并通过3步层析获得了高纯度、高活性的rhIL-13原液,操作过程简单,易于放大生产,为采用基因工程技术工业化生产rhIL-13提供了可靠的技术支持.

[1] WYNN T A.IL-13 effector functions[J].Annu Rev Immunol,2003,21:425-456.

[2] DE WAAL M R,FIGDOR C G,HUIJKENS R,et al. Effects of IL-13 on phenotype,cytokine production and cytotoxic function of human monocyte.Comparison with IL-4 and modulation by IFN2γor IL-10[J].J Immunol, 1993(11):6370-6381.

[3] MINTY A,CHALON P,DEROCQ J M,et al. Interleukin-13 is s new human lymphok in regulating inflammatory and immune responses[J].Nature,1993,362 (6417):248-250.

[4] ROLLING C,TRETON D,BECKMANN P,et al.JAK3 associates with the human interleukin-4 receptor and is tyrosine phosphorylated following receptor triggering [J].Oncogene,1995,10(9):1757-1761.

[5] KORNMANN M,KLEEFF J,DEBINSKI W,et al.Pancreatic cancer cells express interkeukin-13 and-4 receptors,and their growth is inhibited by pseudomonas exotoxin coupled to interleukin-13 and-4[J].Anticancer Res, 1999,19:125-131.

[6] MCKENZIE A N,CULPEPPER J A,DE WALL M R,et al.Interleukin 13,a T-cell-derived cytokine that regulates humanmonocyte and B-cell function[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(8):3735-3739.

[7] 王文,田志刚,刘钟滨,等.hIL-13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[J].中国免疫学杂志,1998,14 (5):322.

[8] 江阳,黄伟达,时宏珍,等.rhIL-13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究[J].苏州医学院学报,2001,21 (2):117.

[9] 高燕,年四季,徐文峰,等.IL-13和IL-33重组蛋白的原核表达和纯化[J].泸州医学院学报,2015,38(5):449-454.

[10] 国家药典委员会.中国药典:三部附录ⅢB高效液相色谱法[M].2010版.北京:中国医药科技出版社,2010.

Expression,Purification and Identification of Recombinant Human Interleukin-13 in Escherichia coli

LIN Huihuang1,2,LIU Chunfeng2,YIN Fenghong2,DING yumei1,CHEN Qingxi1*

(1.School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Amoytop Biotechnique Company of Xiamen,Xiamen 361028,China)

The recombinant human interleukin-13(rhIL-13)fusion protein was expressed in Escherichia coli,and conducted in the 300 L fermentation and induced by isopropylβ-D-thiogalactoside(IPTG),then bacteria were harvested by centrifugation.The bacteria pellet was dissolved,denaturalized,renatured and affinity chromatography was performed to obtain the fusion protein;after proteolysis by enterokinase(EK),affinity chromatography and exclusion chromatography,about 30 mg high purity rhIL-13 was obtained per liter of fermentation liquid.Subsequently,the purity of rhIL-13 was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),showing the purity of more than 98.75%,and the result of size-exclusion of high performance liquid chromatography(HPLC-SEC)analysis was 100%.The molecular weight by mass spectrometry(MS)analysis was 12 348 u, the same as the theoretic value.In addition,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)colorimetric method was performed to determine the specific activity of protein,and the result was more than 8.0×106IU/mg.The number and position of disulfide bond were also analyzed by HPCL and MS,and data showed that the disulfide bond number and position were consistent with the theoretic values.The high purity and activity of rhIL-13 was obtained by this process,which is simple and well suited for large scale production.

recombinant human interleukin-13(rhIL-13);expression;purification;identification

Q 356.1

A

0438-0479(2016)06-0836-06

10.6043/j.issn.0438-0479.201601013

2016-01-11 录用日期:2016-03-08

国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA021604)

chenqx@xmu.edu.cn

林辉煌,刘春凤,尹凤红,等.重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55(6):836-841.

LIN H H,LIU C F,YIN F H,et al.Expression,purification and identification of recombinant human interleukin-13 in Escherichia coli[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(6):836-841.(in Chinese)