长期饲喂钬对鲤鱼非特异性免疫酶活性的影响

吴红松

菏泽学院，菏泽274015

长期饲喂钬对鲤鱼非特异性免疫酶活性的影响

吴红松*

菏泽学院，菏泽274015

以鲤鱼为研究对象,进行为期60 d的饲喂试验,研究了硝酸钬对其非特异性免疫的影响。结果表明:与对照组相比,在实验剂量范围内,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)在肝脏中呈先升高后降低的趋势, SOD、GSH-Px酶活性在20mg·kg-1时,升高显著(P＜0.05),三者在65mg·kg-1时都被显著抑制(P＜0.05)；在肾中都被诱导,在65mg·kg-1升高显著(P＜0.05)。肝肾中丙二醛(MDA)含量都变化不显著(P＞0.05)。抗超氧阴离子自由基、抑制羟自由基能力和单胺氧化酶(MAO)活性都降低,且在65mg·kg-1时降低显著(P＜0.05或P＜0.01)。因此,在饲料中添加稀土元素钬20、42、65mg·kg-1,能够影响非特异性免疫力,且鲤鱼肝组织比肾脏反应更敏感。

钬；鲤鱼；非特异性免疫

钬属于镧系元素中的重稀土类,在地壳中的丰度为1.4×10-6。作为添加剂,广泛使用于粮食、水果、蔬菜等作物上；应用在畜、禽和水产养殖上。但稀土毕竟不是动植物的必须元素,在生产养殖上的安全应用引起了人们的关注。

据报道,适宜浓度的稀土元素添加给植物,浸种可提高种子的发芽率[1],喷施甜瓜叶面可提高甜瓜果实品质[2],增强作物抗盐渍、抗酸雨等胁迫的能力[3-4]。而高浓度添加则可抑制种子的萌发,降低甜瓜产量和品质,损伤水稻根系,抑制蚕豆幼苗生长。适量的稀土添加到饲料中,可以提高鲫鱼血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性[5],显著提高比目鱼生长性能[6],增加虹鳟鱼采食量、提高日增重[7],增加火鸡体重,降低饲料转化率[8],改善保育期仔猪生长性能[9],增加滩羊血液中白蛋白、血红蛋白等的含量,抑制人体癌细胞的生长增殖[10-13]。但高剂量的添加会降低比目鱼免疫力,降低滩羊血液中的有机成分的含量,损伤小鼠肝、脑细胞,降低其免疫功能,抑制小鼠精子的质量和数量[14-17]。目前发现,大鼠肝脏是稀土元素主要蓄积器官[18],肉牛的主要蓄积器官为肝、肾和肋骨[19],稀土元素均可以磷酸盐形式损害机体细胞[20]。但关于单一稀土元素钬在水产动物体内的效应机理的研究报道较少。

本文以硝酸钬作为饲料添加剂饲喂鲤鱼60 d,通过对鲤鱼肝肾脏内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、单胺氧化酶(MAO)、抗超氧阴离子自由基、抑制羟自由基活性和丙二醛(MDA)含量的研究,从生物化学角度揭示稀土元素钬对鲤鱼非特异性免疫酶活性的影响,以期能为稀土在水产养殖方面安全应用,进一步机理研究和安全评估上,提供参考依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验动物及试剂

鲤鱼,购买自菏泽市牡丹区养殖场,平均体重340.1～436.5 g。硝酸钬(Johnson Matiney Company提供,分析纯)。

1.2 试验方法

1.2.1 实验动物处理

实验前,将硝酸钬以20、42、65mg·kg-1的含量分别添加到基础饲料中(参照中国稀土农用网发布的:鱼类饲料中添加的稀土以50mg·kg-1为宜)[21],混匀,颗粒机成型,再烘干,作为实验组鲤鱼的饵料。实验期间,鲤鱼先在实验室驯养2周(驯养期间无死亡),然后实验设3个平行组,每组36尾鱼,以饲喂基础饲料的鲤鱼作为对照组,玻璃缸(120×80×60 cm)养殖,水温16～18℃,充氧过滤泵供氧(OD＞6mg·L-1),每天8时和16时各投喂1次,换水1次,每次换一半。自然光照下饲喂60 d(期间各组鱼均未出现死亡)。

1.2.2 酶液的提取

每实验组随机取鲤鱼6尾擦干,解剖,分离出肝肾脏。按组织质量与0.65%的生理盐水体积之比为m(g):v(mL)=1:5,匀浆,4℃,4 000 r·min-1,离心15 min,取上清,4℃冰箱保存备用。

1.2.3 酶活性的测定

SOD、CAT、GSH-Px、MAO、抗超氧阴离子自由基活性、抑制羟自由基能力和丙二醛(MDA)含量的测定,均采用由南京建成生物工程研究所提供试剂盒,按照试剂盒说明操作,利用紫外分光法测出吸光值,根据公式计算出各样本的酶活和MDA含量。

1.3 数据处理

利用SPASS软件,求出平均值±标准差,并进行单因素方差分析(ANOVA),各实验组与对照组之间的两两比较采用最小显著差数法(LSD),取显著性水平为0.05。

2 结果(Results)

从图1可以看出,用含硝酸钬饲料饲喂60 d后。随着饲料中硝酸钬含量的增加,鲤鱼肝脏中的CAT活性先升高后降低,与对照组相比,在20mg·kg-1时,升高不显著(P＞0.05)；在42、65mg·kg-1时,肝中CAT活性比对照组极显著降低(P＜0.01)。但肾脏中的CAT活性却不断升高,在20、42mg·kg-1时,升高不显著(P＞0.05)；在65mg·kg-1时,肾中CAT活性比对照组极显著升高(P＜0.01)。

如图2所示,随着饲料中硝酸钬含量的增加,与对照组相比,鲤鱼肝脏中的SOD活性先升高后降低,在20mg·kg-1时,升高显著(P＜0.05)；在42、65mg·kg-1时,显著降低(P＜0.05)。但肾脏中的SOD活性却不断升高,在20、42mg·kg-1时,升高不显著(P＞0.05)；在65mg·kg-1时,升高显著(P＜0.05)。

如图3所示,鲤鱼肝脏中的GSH-Px活性随着硝酸钬剂量的升高呈现先升高后降低的趋势。与对照组相比,在20mg·kg-1时,受到了显著的诱导(P＜0.05)；但在42mg·kg-1时,GSH-Px的活性降低,但差异不显著(P＞0.05)；在65mg·kg-1时,活力显著低于对照组(P＜0.05)。但鲤鱼肾脏中的GSH-Px活性随着硝酸钬剂量的升高而呈现不断升高的趋势,且在剂量为65mg·kg-1时,与对照组相比差异显著(P＜0.05)。

图1 硝酸钬对鲤鱼肝肾CAT活性的影响注:*表示处理组与对照组差异显著(P＜0.05)；**表示处理组与对照组差异极显著(P＜0.01)。Fig.1 Effect of nitrate holmium on CAT activity in the liver and kidney ofC.carpioNote:*shows significant difference compared with control group(P＜0.05) **shows extremely significant difference compared with control group(P＜0.01).

图2 硝酸钬对鲤鱼肝肾SOD活性的影响Fig.2 Effect of nitrate holmium on the SOD activity in the liver and kidney ofC.carpio

图3 硝酸钬对鲤鱼肝脏GSH-Px活性的影响Fig.3 Effect of nitrate holmium on the GSH-Px activity in the liver and kidney ofC.carpio

图4 硝酸钬对鲤鱼肝肾MDA含量的影响Fig.4 Effect of nitrate holmium on the content of MDA in the liver and kidney ofC.carpio

图5 硝酸钬对鲤鱼肝肾抗超氧阴离子自由基活性的影响Fig.5 Effect of nitrate holmium on the scavenging effect of superoxide anion free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如图4所示,与对照组相比,硝酸钬剂量在20、42、65mg·kg-1时,鲤鱼肝、肾脏中MDA含量都有所降低,但与对照组相比,差异都无统计学意义(P＞0.05)。

如图5所示,在鲤鱼肝肾内抗超氧阴离子自由基活力随着硝酸钬剂量的升高,呈先升高后降低的趋势,与对照组相比在20mg·kg-1时,都有所升高,但不显著(P＞0.05)；在42mg·kg-1时,活力都有所降低,肝脏与对照组差异极显著(P＜0.01),而肾脏差异不明显(P＞0.05)；在65mg·kg-1时,都极显著降低(P＜0.01)。

图6 硝酸钬对鲤鱼肝肾抑制羟自由基能力的影响Fig.6 Effect of nitrate holmium on the inhibition of hydroxide free radical in the liver and kidney ofC.carpio

如图6所示,与对照组相比,鲤鱼肝、肾脏中抑制羟自由基能力随着硝酸钬剂量的升高都呈逐步降低的趋势,且变化趋势一致。抑制羟自由基能力在20mg·kg-1时,肝脏内显著降低,肾脏降低不显著(P＞0.05)；但在42、65mg·kg-1时,肝肾脏中都呈极显著降低(P＜0.01)。

图7 硝酸钬对鲤鱼肝肾MAO活性的影响Fig.7 Effect of nitrate holmium on the MAO activity in the liver and kidney ofC.carpio

如图7所示,鲤鱼肝肾脏中MAO活力都随着硝酸钬剂量的升高而降低,与对照组相比,在20mg·kg-1时,两者都差异不显著(P＞0.05)；在42mg·kg-1时,仅肝脏中差异显著(P＜0.05),在65mg·kg-1时,肾脏中差异显著(P＜0.05),肝脏中差异极显著(P＜0.01)。

3 讨论(Discussion)

田蜜等[22]认为轻稀土元素进入生物体后主要累积于肝脏。Shinohara等[23]报道了钬、铈、镧等12种稀土元素进入小鼠后主要分布在肝、肾等组织。崔丽卿等[24]认为稀土离子半径较小,表现为硬酸性,容易与作为硬碱的氧结合,可以通过此机制清除活性氧。活性氧的数量与杀菌力存在相关性,是反映非特异性免疫能力的一项指标。申治国等[25]通过研究在0.01～0.5 mmol·L-1浓度下铈对正常肝细胞和V79细胞内ROS浓度的影响,为低浓度稀土能清除机体内自由基提供了直接的依据。本文用含硝酸钬饲料饲喂鲤鱼60 d后,与对照组相比,鲤鱼肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均随饲喂剂量升高呈现低促高抑的特点,在饲料中硝酸钬含量为20mg·kg-1时,CAT活力升高不显著,SOD、GSH-Px均升高显著；在42mg·kg-1时,CAT、SOD显著降低,GSH-Px降低不显著；在65mg·kg-1时,3种酶与对照组相比均显著降低。这与汪承润等[26]用钬溶液给小鼠腹腔注射染毒后现象一致,发现SOD,POD和CAT 3种抗氧化酶活力在10～40mg·kg-1剂量范围内,3种酶活力均随剂量的增加而升高；在40～60mg·kg-1剂量范围内,3种酶活力呈现下降趋势,表现出“低促高抑”的效应的结果一致。同时也与廖红艳等[27]发现的低剂量的镧对小鼠肝脏中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性表现出激活作用,高剂量表现出抑制作用的结果相一致。郝述霞等[28]研究发现,低剂量稀土可抑制过氧化,高剂量可促进过氧化。刘颖等[29]以“长乐”和La(NO3)3灌大鼠胃6个月后也发现,低剂量均能抑制自由基的产生,提高肝组织中SOD、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。肾脏中 CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趋势,在65mg·kg-1时升至最大,且均与对照组相比差异显著。可见,与肾脏中酶活性相比,肝脏对硝酸钬剂量的增加更加敏感。这与黄可欣等[30]给昆明小鼠胃灌La(NO3)3后肾脏中GSH-Px较对照组显著升高相似。这可能是由于钬离子与鲤鱼肝肾组织内过氧化物的配位结合阻止了自由基的生成,也可能是钬离子通过与生物体内氧自由基的磁相互作用掩蔽自由基阻止单电子传递[31]。可见,稀土的抗氧化作用是通过其与自由基的相互作用以及增强抗氧化酶的活性来实现的。

环境胁迫诱发的活性氧自由基伤害生物膜的过程中,最重要的脂质过氧化产物是MDA,它是一种高活性的脂质过氧化物,能交联脂类、核酸、糖类及蛋白质,也可使蛋白质的SH基氧化。在实验剂量范围内,与对照组相比,鲤鱼肝肾中MDA含量均差异不显著。与巩菊芳等[32]发现的长期饮用不同剂量三硝酸钬溶液对大鼠肝、肾中MDA含量无明显变化的结果一致。这表明在20～65mg·kg-1剂量范围内,不会使鲤鱼肝肾细胞膜发生脂质过氧化,可能是由于钬离子结合细胞膜,使其免受了自由基的氧化作用。这与刘湘陶等[33-34]研究的多种稀土离子对细胞膜脂质过氧化有较强的抑制作用的结果相似。

生物体内的氧自由基通过酶促反应,膜电子传递泄露,自动氧化不断产生包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等,其中最主要、最具破坏性的也最具破坏性的是羟自由基。实验中鲤鱼抗超氧阴离子自由基能力,与对照组相比,均在剂量为20mg·kg-1时有所升高,在42mg·kg-1时,肝脏呈极显著降低,而肾脏降低不明显；在65mg·kg-1时,肝肾内均降低极显著。肝肾中抑制羟自由基能力,随着饲料中硝酸钬含量的增加而显著降低,且与对照组相比,在42、65mg·kg-1时,都下降极显著。可能是钬离子清除鲤鱼体内多余的OH-,O2-自由基,使肝肾细胞中抗超氧阴离子自由基、抑制羟自由基能力降低。肝肾中抗超氧阴离子自由基能力没有抑制羟自由基能力的降低的显著,可能与钬离子与不同自由基的相互作用强弱有关。

单胺氧化酶(MAO)是一类黄素酶,广泛分布于生物体内各组织器官,尤以肝、肾等组织内含量最多,主要参与生物源氨代谢,能够催化多种结构的胺类[35]。MAO变化可提示机体肝肾组织的损伤,尤其肝受损时MAO活性明显升高。本文鲤鱼肝脏中MAO在剂量为20mg·kg-1时,升高不显著；在剂量为42mg·kg-1时,显著降低,在65mg·kg-1时,降低极显著。而鲤鱼肾脏中MAO随钬浓度升高而不断降低,在剂量为65mg·kg-1时,降低显著,表现出一定的组织差异性。可见,一定浓度的钬离子可能通过与自由基相互作用,降低了机体中MAO活性,从而减少胺代谢产物对肝肾组织的损伤作用。

综上所述,在添加剂量范围内,饲料中添加的硝酸钬影响了鲤鱼非特异性免疫力的酶活性。随饲喂剂量升高,肝中的CAT、SOD、GSH-Px活性均呈现低促高抑的特点,肾中的CAT、SOD、GSH-Px活性呈逐步升高的趋势,抗超氧阴离子自由基能力、抑制羟自由基能力在肝肾中均显著降低。一定剂量钬离子具有清除自由基能力,且表现出一定组织差异性,相同剂量下,肝比肾更为敏感[36]。肝肾中MDA含量都变化不显著,MAO活性的降低,表明添加剂量范围内的硝酸钬,不会对肝肾细胞膜造成脂质过氧化等组织损伤。稀土元素的这种影响机制究竟是什么,还有待进一步深入研究。

致谢:本文得到了山东省菏泽学院张贵生副教授、朱道玉教授等的辛苦协助，在此表示感谢。

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Effect of Holmium on the Activities of Nonspecific Immune Enzymes in Cyprinus carpio

Wu Hongsong*
Heze University,Heze 274015,China

5 November 2015 accepted 24 December 2015

In order to investigate the effects of nitrate holmium on innate immune response ofCyprinus carpio(C. carpio),a 60-day period of feeding trial was conducted.The result showed that,with the increasing of nitrate holmium,the activities of catalase(CAT),the superoxide dismutase(SOD)and the glutathione peroxidase(GSH-Px)in the liver were all increased first and then decreased.In the liver,the activities of SOD and GSH-Px were induced significantly when the concentration of nitrate holmium was 20mg·kg-1(P＜0.05),while the three enzymes mentioned above were significantly inhibited in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05).Additionally, the activities of the three enzymes in the kidney were all induced remarkably when the dose of nitrate holmium was 65mg·kg-1(P＜0.05).Both in the liver and kidney,the malonaldehyde(MDA)appeared little changes(P＞0.05)in the range of experimental concentrations.The activities of monoamine oxidase(MAO),the scavenging effects of hydroxyl and the superoxide anion free radical in the liver and kidney were all decreased,especially in the group including 65mg·kg-1nitrate holmium(P＜0.05 orP＜0.01).These results suggested that the addition of rare-earthelement holmium to the feed could significantly affect the immunity ofC.Carpio in the range of experimental concentrations and the liver was more sensitive to holmium than the kidney.

cerium;C.carpio;innate immunity

2015-11-05 录用日期:2015-12-24

1673-5897(2016)1-375-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151105002

吴红松.长期饲喂钬对鲤鱼非特异性免疫酶活性的影响[J].生态毒理学报,2016,11(1):375-381

Wu H S.Effect of holmium on the activities of nonspecific immune enzymes inCyprinus carpio[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):375-381(in Chinese)

山东省教育厅科研发展计划项目(J08LF54)；山东省动物生理生化与应用重点实验室资助

),E-mail:hellowhs@163.com

简介:吴红松(1977-)，女，山东省菏泽市人，硕士，讲师，研究方向为动物学。