纳米二氧化铈对蛋白核小球藻和大型溞的毒性及其在大型溞体内的形态转化

王婧坤，马宇辉，赵鑫，冯承莲，朱维晃，张智勇

1.西安建筑科技大学，西安710055

2.中国科学院高能物理研究所，北京100049 3.中国环境科学研究院，北京100012

纳米二氧化铈对蛋白核小球藻和大型溞的毒性及其在大型溞体内的形态转化

王婧坤1,2,3，马宇辉2,*，赵鑫3,#，冯承莲3，朱维晃1，张智勇2

1.西安建筑科技大学，西安710055

2.中国科学院高能物理研究所，北京100049 3.中国环境科学研究院，北京100012

随着纳米技术的飞速发展,纳米材料的应用日益广泛。同时,这类具有独特物理化学特性的微小颗粒对环境和健康的影响引起了人们的关注。本工作参考国际经济合作与发展组织(OECD)化学品生态毒理测试方法,以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和大型溞(Daphnia magna)为受试生物,研究了CeO2纳米颗粒暴露对小球藻生长、叶绿素含量和细胞内活性氧水平以及大型溞运动能力的影响,分析了大型溞体内铈的形态。随着暴露浓度的升高和时间延长,CeO2纳米颗粒逐渐抑制小球藻的生长,导致叶绿素水平的降低和活性氧水平升高。暴露96 h后,CeO2纳米颗粒对小球藻生长的EC50为30.4mg·L-1,而对大型溞活动抑制的24 h、48 h-EC50分别为430.2mg·L-1和142.7mg·L-1。根据中华人民共和国环境保护行业标准中的毒性分级标准,CeO2纳米颗粒对小球藻属于中毒性物质,对大型溞属于低毒性物质。CeO2纳米颗粒在大型溞体内主要以Ce(IV)的形式存在,约有3%转化为Ce(III)。对CeO2纳米颗粒的水生态效应给予足够重视并深入研究其毒性作用机制。

纳米二氧化铈；小球藻；大型溞；毒性

随着纳米科技的快速发展,纳米材料的应用越来越广泛。与此同时,纳米材料可以通过生产设备、污水处理、商品使用等途径直接或间接进入水环境,对水生生物造成危害,其中ZnO、CuO、TiO2等纳米材料对藻类的毒性主要表现在对其光合作用的影响[1],如改变叶绿素含量或是干扰光合电子运转,使藻类消耗大量能量；多种金属纳米材料对大型溞的死亡率、繁殖能力、细胞毒性及生理变化(如跳跃频率、后腹弯曲运动、心跳速率)等[2-4]均有影响；鱼类毒性研究表明Ag、ZnO、nC60等纳米材料会对胚胎发育情况(孵化时间、畸形、幼鱼体长等)、死亡率、病理学分析及抗氧化基因的表达等产生影响[5-6]。

CeO2纳米颗粒是一种典型的纳米材料,因其独特的储存和释放氧的能力及高温快速氧空位扩散能力而被广泛应用于氧化还原反应中,成为极具应用前景的催化材料[7-9]、pH传感材料[10]、高温氧敏材料[11-12]、固体氧化物燃料电池中的电极材料[13-14]、化学机械抛光研磨料[8,15]以及电化学池中的膜反应器材[16]等。最近,CeO2纳米颗粒正越来越多地应用在汽车行业,既可用于减少燃烧尾气微粒含量的柴油添加剂,又可用于催化转换器[11]。然而,随着用量的逐渐增大,CeO2纳米颗粒不可避免的被释放到环境中,给环境物种带来潜在影响[17],因此迫切需要对CeO2纳米颗粒的环境生态效应进行研究。

浮游生物是水生态系统的重要功能类群,具有种类多、分布广、丰度高等特点,对于维持生态系统的结构与功能起到关键作用[18]。关于CeO2纳米颗粒对浮游生物中的藻类和大型枝角类的影响已有一些报道。例如,Ismael等[19]研究了CeO2纳米颗粒对蓝藻(Anabaena)和月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的毒性,在纯水中暴露24 h后EC50值分别为0.27～6.3mg·L-1和2.4～29.6mg·L-1。类似的研究表明,10～20 nm CeO2和微米级CeO2对月牙藻暴露72 h的IC50值分别为(10.3±1.7)mg·L-1和(66±22)mg·L-1[14,20]。 Hoecke等[21]研究了尺寸分别为 14、20、29 nm的CeO2纳米颗粒对3种不同营养级的水生生物的毒性。暴露24 h后,CeO2纳米颗粒对月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)、大型溞(Daphnia magna)和斑马鱼胚胎(zebrafish embryos)没有明显的毒性,暴露72 h后3种尺寸的纳米颗粒对绿藻的半数抑制浓度为7.6～28.8mg·L-1。Gaiser等[22]的研究表明10mg·L-1的CeO2纳米颗粒对大型溞的存活率没有影响,其毒性远低于相同浓度的纳米银。同样的,Jemec等[23]的研究也表明低于 500mg·L-1的CeO2纳米颗粒对大型溞没有毒性。另外,Artells等[24]对其他枝角类生物的研究结果显示,CeO2纳米颗粒对同形溞(Daphnia similis)和蚤状溞(Daphnia pulex)48 h的EC50分别为0.26mg·L-1和91.79mg·L-1。上述研究使我们初步了解了CeO2纳米颗粒对部分藻类和枝角类的毒性作用,但考虑到不同物种之间的差异,还需要对CeO2纳米颗粒对水生态毒性的进行更广范围的研究并开展毒性机制的探讨。

本工作选取自然界广泛分布的浮游生物蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和大型溞(Daphnia magna)为受试对象,采用国际经济合作与发展组织(OECD)化学品生态毒性测试的标准方法研究CeO2纳米颗粒进入水环境后的生态毒理效应。研究结果有助于全面评价CeO2纳米颗粒的水生毒性,同时将为减少纳米材料对生态环境的影响和纳米材料的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 藻液培养

取长势良好的蛋白核小球藻藻种在无菌的条件下接种到盛有OECD 201培养基的锥形瓶中,在人工气候箱中培养(PRX-450D,宁波赛福实验仪器有限公司,宁波),培养温度控制在(24±1)℃,光暗比为12 h:12 h,设置光照强度为(3 000±10%)lx。尽可能保证对藻液光照均匀,每天按时摇晃培养瓶数次,避免小球藻细胞团聚和贴壁现象。每隔10天重新接种一次避免藻种老化。取对数生长期的小球藻进行实验。

1.2 小球藻暴露实验

CeO2纳米颗粒采用沉淀法合成[25-27]。调节颗粒浓度为2 000mg·L-1作为母液,室温超声震荡20 min,使CeO2纳米颗粒均匀分散。实验前使用小球藻培养基稀释,使实验组所加入的CeO2纳米颗粒终浓度为:0.1、1、10、50和200mg·L-1,使用小球藻培养基作为实验对照组。在50 mL锥形瓶中分别加入各浓度梯度的CeO2纳米颗粒悬液和藻液,调节小球藻细胞密度为2×106cell·mL-1,溶液终体积为15 mL,每组设3个平行,实验结果取平均值。将锥形瓶置于恒温摇床,维持光照强度为120μE·m-2·s-1,调节转速为(90±5)r·min-1,分别于24、48、72、96 h后测定相应的指标。

1.3 小球藻生长抑制检测方法

小球藻EC50的测定:分别于暴露后的第24、48、72、96小时使用酶标仪测定各浓度组在680 nm处的吸光度,计算小球藻细胞个数。由于CeO2纳米颗粒的浊度会影响吸光度的测定,因此测得的吸光度需要扣除纳米材料的背景值。使用SPSS概率单位法计算暴露96 h的EC50。

叶绿素含量测定:取50μL的绿藻暴露液加入200μL的乙醇溶液,混匀后加入96孔板中,孔板避光震荡3 h,使用酶标仪测定其荧光强度(Ex/Em: 420 nm/671 nm)。

活性氧(ROS)的测定:分别于暴露后24、48、72、96 h使用荧光探针二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)(分析纯,Sigma)检测各组细胞内ROS的水平。DCFH-DA进入细胞后在细胞内酯酶的作用下转化为DCFH,DCFH被细胞内ROS氧化生成有荧光的DCF,通过检测细胞内DCF的荧光强度来反映ROS的水平。取180μL小球藻暴露液,加入20μL的DCFH-DA,DCFH-DA终浓度为10μmol·L-1,混匀后加入黑色96孔板中,于37℃孵育20 min,酶标仪(spectraMax M2,Molecular Devices Corporation,USA)测定各组荧光强度(Ex/Em:488 nm/ 525 nm)。

1.4 大型溞培养

大型溞受赠于中国科学院生态环境研究中心,并在实验室中培养超过一年。实验室中连续培养5代以上孤雌生殖得到纯品系,驯化用水为OECD 202培养基。人工气候箱培养,光照强度为800 lx,培养温度为(20±1)℃,隔天更换培养液。实验前使用重铬酸钾检测大型溞的敏感性。结果显示,重铬酸钾暴露24 h后EC50为0.884mg·L-1,符合实验要求。

1.5 大型溞活动抑制实验

分别在每个烧杯中放置溞龄为6～24 h的纯化3代以上新生溞10只,加入终浓度分别为1、10、50、100、200、500和1 000mg·L-1的纳米CeO2,每组设3个平行。实验期间大型溞不喂食。分别于暴露后24 h和48 h观察大型溞的活动情况。以大型溞活动受抑制作为观察标准,轻轻晃动实验容器,若15 s之内大型溞不能游动,认为其运动能力受到抑制。使用SPSS概率单位法计算EC50值。

1.6 组织中Ce化学种态分析

将纳米CeO2处理的大型溞清洗干净,在-50℃、0.06 mbar下冷冻干燥,然后将干样用研钵磨成粉末,压片后用于XANES分析。利用北京同步辐射装置(BSRF)1W1B XAFS实验站进行图谱采集。储存环电子能量2.5 GeV,流强～200 mA。标准样品纳米CeO2、CePO4、Ce(CH3COO)3采用透射模式,大型溞样品采用19元高纯锗固体阵列探测器检测。所得谱图用Athena软件进行归一化,采用线性拟合(linear combination fitting,LCF)对各组分比例进行分析。

1.7 数据分析

每种试验均重复3次,结果以平均值±标准差表示。实验数据用SPSS 16.0统计软件进行方差分析,采用Tukey’s检测各处理组与对照组之间的差异显著性,P＜0.05表示有显著性差异,P＜0.01表示有极显著差异。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 CeO2纳米颗粒的表征

TEM(透射电子显微镜)结果显示,合成的CeO2纳米颗粒形貌稳定,为缺角的八面体结构。粒径均一,平均粒径为(6.44±0.42)nm(图1)。DLS结果显示(表1),CeO2纳米颗粒在二次水中的水动力学直径显著大于TEM测定结果,说明在水中会发生一定程度的团聚。但在绿藻培养基、大型溞培养基中团聚更明显。Zeta电位测定结果显示,CeO2纳米颗粒在二次水的Zeta电位为+(44.6±1.0)mV；在绿藻培养基、大型溞培养基中,CeO2纳米颗粒的Zeta电位显著下降,Zeta电位测定结果与DLS测定得到的水和动力学直径结果一致。

图1 CeO2纳米颗粒的TEM图片Fig.1 TEM images of CeO2NPs

2.2 CeO2纳米颗粒对小球藻生长的影响

从图2中可以看出,浓度为0.1mg·L-1时,CeO2纳米颗粒对小球藻细胞的生长没有明显抑制。随着浓度升高,在暴露初期(t≤48 h)CeO2纳米颗粒对小球藻细胞的抑制作用不明显；但是随着时间延长,抑制作用逐渐增强。浓度为200mg·L-1时,小球藻细胞生长基本停滞,藻体颜色变浅,甚至发白,抑制率高达90%。通过概率单位法计算得到CeO2纳米颗粒对小球藻96 h的EC50为30.4mg·L-1,95%置信区间为(13.5,40.3),根据原国家环境保护总局发布的中华人民共和国环境保护行业标准[28]中藻类生长抑制毒性分级标准,CeO2纳米颗粒对小球藻属于中毒性物质。

纳米材料可能因为遮光效应使实验体系的实际光强下降,从而抑制藻类的生长。本实验中采用50 mL的锥形瓶装15 mL的溶液,液层厚度约为1.4 cm,使用摇床在一定转速下保证溶液处于紊流状态,并随机变换锥形瓶在摇床的位置使藻类均匀受光,同时在底部或侧面加以辅光,以此得到比较理想的结果。Baun等[29]的结果表明,在采取诸如降低光径和保持湍流混合等光强补偿措施后,藻类生长抑制实验可用于浓度≤10mg·L-1的污染土壤悬浮液的生态毒性检测。

图2 CeO2纳米颗粒对小球藻的生长抑制Fig.2 Effects of CeO2NPs on the growth of Chlorella pyrenoidosa

表1 水中和培养基中CeO2纳米颗粒的物理化学性质Table 1 The physicochemical characteristics of CeO2NPs in water and culture media

2.3 CeO2纳米颗粒对小球藻叶绿素含量的影响

叶绿素是小球藻细胞进行光合作用的物质基础,可以通过检测细胞内叶绿素的含量来反映细胞的生长状况。不同浓度CeO2纳米颗粒处理后,细胞内叶绿素的含量变化如图3所示。浓度为0.1mg·L-1时,细胞内叶绿素含量随时间的延长先增加后减小,但与对照组相比没有显著性差异。随着暴露浓度的升高及暴露时间,小球藻细胞内的叶绿素含量逐渐降低。浓度为200mg·L-1时,暴露细胞48 h后叶绿素含量仅是同时刻对照组的25.1%(P＜0.01), 96 h后,与对照组相比减少了90%以上(P＜0.01)。

2.4 CeO2纳米颗粒对小球藻体内活性氧(ROS)的影响

图4结果显示了纳米CeO2暴露后,小球藻细胞内活性氧(ROS)水平的改变。由图中可以看出,0.1mg·L-1组小球藻细胞内ROS的水平与对照组相比无显著差异,但随纳米颗粒浓度的增加和暴露时间的延长,细胞内ROS的水平与对照组相比显著升高。浓度为50mg·L-1和200mg·L-1的纳米颗粒暴露细胞96 h,小球藻体内的活性氧水平分别为对照组的2.5倍和4倍。因此,我们推测纳米颗粒暴露细胞后可以诱导细胞内ROS的产生,增加细胞内氧化应激的程度,从而影响细胞的存活。

图3 CeO2纳米颗粒暴露后小球藻叶绿素水平的变化Fig.3 Effects of CeO2NPson the chlorophyll contents ofChlorella pyrenoidosa

图4 CeO2纳米颗粒对小球藻细胞内ROS水平的影响Fig.4 Effects of CeO2NPs on the ROS level of Chlorella pyrenoidosa

2.5 纳米颗粒对大型溞的急性毒性

CeO2纳米颗粒对大型溞的24 h和48 h EC50分别为430.2mg·L-1和142.7mg·L-1,95%置信区间分别为239.8～587.4mg·L-1和85.7～210.9mg·L-1。其48 h EC50值大于100mg·L-1,根据原国家环境保护总局发布的中华人民共和国环境保护行业标准[28]中溞类急性活动抑制毒性分级标准,实验中所用CeO2纳米颗粒对大型溞属于低毒性物质,这与Gaiser[22]和Hoecke等[21]的研究结果相似；而Artells等[24]研究发现,CeO2纳米颗粒对同形溞和蚤状溞的48 h-EC50分别为0.26mg·L-1和91.79mg·L-1。以上结果说明,纳米颗粒的物化性质不同,采用的溞类品种不同,表现出的生物效应可能会有明显的差异。

图5 在CeO2纳米颗粒悬液中暴露不同时间的大型溞注:A,0 h；B,24 h；C,48 h。Fig.5 The photographs ofDaphnia magnaafter exposure to CeO2NPsNote:A,0 h;B,24 h;C,48 h.

大型溞是滤食性生物,能滤食水中的藻类和碎屑,同时也会摄入CeO2纳米颗粒。如图5所示箭头所指消化道,CeO2纳米颗粒暴露24 h就可以看到大型溞对纳米颗粒的摄取,且随着时间的延长,大型溞对纳米颗粒的摄入量显著增加,充满整个消化道。此外,大型溞体表具有疏水性,其表面也能够吸附大量CeO2纳米颗粒(如图6C右下角箭头),纳米颗粒吸附于大型溞体表后能够显著抑制其活动能力。纳米颗粒暴露48 h后,不仅能够在大型溞的体内观察到大量的纳米颗粒的存在,而且在大型溞的体表也有吸附的纳米颗粒,尤其在触角上吸附的纳米颗粒的数量较多(见图6C),显著抑制了大型溞的活动。

2.6 大型溞体内Ce的化学形态分析

基于同步辐射的XANES是分析元素化学形态的有力手段,它可以灵敏地区分元素的价态和局域结构。如图6所示,Ce(III)在低能处有一尖峰(图中实线),Ce(IV)在高能处有2个宽峰(图中虚线)。对比样品与标准化合物XANES谱图可以看出,纳米CeO2处理48 h后,大型溞体内Ce的XANES谱与Ce(IV)O2本身十分接近,通过线性拟合(LCF)得到大型溞体内的 Ce主要以 IV价形式存在,转化为Ce(III)的比例约为3%。LCF拟合曲线和XAENS谱吻合良好,结合拟合参数(R-factor=0.000177)可以证明该拟合的结果可靠。

CeO2纳米颗粒的作用有可能来自吸附在体表的纳米颗粒对大型溞活动的抑制、摄入大型溞体内的CeO2纳米颗粒自身或释放的Ce3+离子引发的毒性效应等,其确切机制有待进一步研究。

图6 暴露于CeO2纳米颗粒后大型溞中Ce的XANES谱图Fig.6 XANES spectra of Ce inDaphnia magna after exposure to CeO2NPs

综上可知:

(1)高浓度CeO2纳米颗粒水悬浮液可以抑制小球藻的生长和大型溞的活动,并引起大型溞的死亡。

(2)CeO2纳米颗粒对小球藻生长96 h的EC50值为30.4mg·L-1,属于中毒性物质；对大型溞的48 h EC50值为142.7mg·L-1,属于低毒性物质。

(3)根据XANES结果,处理48 h后CeO2纳米颗粒在大型溞体内主要以Ce(IV)存在,转化为Ce(III)的比例很低。

致谢:感谢中国科学院生态环境研究中心李兆利老师的帮助。

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*共同通讯作者(Co-),E-mail:zhaoxin@craes.org.cn

Toxicity of CeO2Nanoparticles to Chlorella pyrenoidosa and Daphnia magna,and Its Transformation Inside the Daphnia magna

Wang Jingkun1,2,3,Ma Yuhui2,*,Zhao Xin3,#,Feng Chenglian3,Zhu Weihuang1,Zhang Zhiyong2
1.Xian University of Architecture and Technology,Xi’an 710055,China
2.Institute of High Energy Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China
3.China Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China

16 April 2015 accepted 6 July 2015

With the rapid development of nanotechnology,nanomaterials have been used in many applications. Meanwhile,the potential impacts of these tiny particles with unique physicochemical properties on the environment and human health have attracted increasing attention from the public.In accordance with the standard OECD Guidelines for the testing of chemicals(OECD 201 and 202),we studied the ecotoxicity of CeO2nanoparticles(nCeO2)with the size of 6.44 nm to green algae(Chlorella pyrenoidosa)and water-flea(Daphnia magna).Effects of nCeO2on the algal biomass,chlorophyll content,and cellular reactive oxygen species(ROS)level as well as daphnia acute immobilization were investigated.With the increase of exposure concentration and time,the growth of chlorella cell was gradually inhibited.The content of chlorophyll in the algae decreased,whereas the cellular ROS level increased under the stress of nCeO2.The 96 h EC50of nCeO2on the growth ofChlorella pyrenoidosa was 30.4mg·L-1and the 24 and 48 h-EC50of nCeO2onDaphnia magnawere 430.2 and 142.7mg·L-1,respectively.According to the grading standards of the People's Republic of China on environmental protection industry, nCeO2can be assumed to be of moderate and low toxicity forChlorella pyrenoidosaandDaphnia magna,respectively.The majority of Ce inDaphnia magnawas present as Ce(IV),while about 3%was transformed into Ce(III). Further research on the toxic mechanisms of nCeO2is highly needed in order to minimize the adverse ecological effects.

CeO2nanoparticles;Chlorella pyrenoidosa;Daphnia magna;toxicity

2015-04-16 录用日期:2015-07-06

1673-5897(2016)1-362-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150416003

王婧坤,马宇辉,赵鑫,等.纳米二氧化铈对蛋白核小球藻和大型溞的毒性及其在大型溞体内的形态转化[J].生态毒理学报,2016,11(1):362-368

Wang J K,Ma Y H,Zhao X,et al.Toxicity of CeO2nanoparticles toChlorella pyrenoidosaandDaphnia magna,and its transformation inside theDaphnia magna[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):362-368(in Chinese)

环保部环保公益项目(201209012)

王婧坤(1990-),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理,E-mail:wangjingkun1990@163.com；

),E-mail:mayh@ihep.ac.cn

简介:马宇辉(1978—)，女，博士，副研究员，主要研究方向纳米材料的毒理效应。

赵鑫(1980—)，女，硕士，工程师，主要研究方向为环境标准。