基于发光细菌的细颗粒物(PM2.5)可溶性提取液综合生物效应测试方法及其应用

孙成华， 石爱军,*， 刘保献， 张大伟， 陈添， 刘建武， 刘康， 周健楠， 洪姗姗

1.北京市环境保护监测中心，北京 100048

2.大气颗粒物监测技术北京市重点实验室，北京 100048

3.北京师范大学核科学与技术学院，北京 100875

4.北京市环境保护局，北京 100048

基于发光细菌的细颗粒物(PM2.5)可溶性提取液综合生物效应测试方法及其应用

孙成华1,2， 石爱军1,2,*， 刘保献1,2， 张大伟1,2， 陈添4， 刘建武3， 刘康1,2， 周健楠1,2， 洪姗姗1,2

1.北京市环境保护监测中心，北京 100048

2.大气颗粒物监测技术北京市重点实验室，北京 100048

3.北京师范大学核科学与技术学院，北京 100875

4.北京市环境保护局，北京 100048

为科学评估PM2.5对生物体综合生物效应,研究建立了利用费氏弧菌检测PM2.5水溶性提取液的毒性测试方法,确立了PM2.5样品提取液发光细菌毒性测试实验质量控制办法。对春节烟花爆竹燃放和沙尘污染过程的PM2.5实样测试表明:烟花爆竹燃放期间的PM2.5样品提取液发光抑制率值与微量金属元素等有毒有害组分浓度显著相关；沙尘污染期间的PM2.5样本提取液中地壳元素浓度和发光抑制率值显著不相关。

发光细菌；生物毒性测试；发光抑制率；PM2.5

颗粒物(particulate matter,PM)特指悬浮在空气中的固体颗粒或液滴,是空气污染的主要来源之一。颗粒物能够在大气中停留很长时间,并可随呼吸进入体内,粒径大小不同被吸入并沉积在呼吸系统的部位不同,对机体的危害也有明显差异。空气动力学直径小于或等于2.5μm的颗粒物称为细颗粒物(PM2.5),与较粗的大气颗粒物相比,PM2.5粒径小,相对表面积大,活性强,易附带有毒、有害物质(例如,重金属、微生物等),且在大气中的停留时间长、输送距离远,因而对人体健康和大气环境质量的影响更大。

PM2.5会对呼吸道及肺产生氧化损伤,引发系统性炎症反应与神经调节改变,从而影响呼吸系统、心血管系统和中枢神经系统等。流行病学研究表明心律失常、心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化、冠心病等都与PM2.5暴露有关[6]。目前应用在PM2.5生物效应测试的毒理学实验方法主要有动物体内染毒实验[1,7](现多用小鼠)和体外培养细胞毒性实验[1-4,8,18-23]。动物染毒实验所需样本量大,且实验周期较长。一般按动物体重选择染毒剂量,动物个体越大所需样本量越多,染毒时间一般在24 h以上,刘晓丽等[7]在研究PM2.5对大鼠心肺睾丸的氧化损伤作用时,选择3个低、中、高染毒组(1.5,7.5,37.5mg·kg-1),1次实验需要采集至少5 d以上的细颗粒物样品,样品经提取浓缩冻干后配制成浓缩液,气管滴注染毒。

PM2.5通过对呼吸道细胞及心血管系统氧化应激作用产生活性氧(ROS),刺激炎症因子的产生是目前被普遍接受的细颗粒物致病机理模式。体外培养细胞的毒性实验主要针对这一机制开展研究[1-4,8,18-23],这些研究多数采用部分颗粒物提取物、高剂量染毒,分别针对颗粒物的某一方面的毒性作用评价其对健康的危害,同样需要采集数天细颗粒物(PM2.5)样品,提取浓缩冻干后配制成不同浓度溶液再开展实验,样品提取过程会造成部分挥发性有机物组分的损失[2]。体外细胞培养对实验环境要求较高,操作技术复杂,实验染毒时间同样需要24 h以上。另外针对氧化应激效应,二硫苏糖醇(DTT)氧化能力实验[2-3,5]、质粒DNA评价法[24-25]也逐渐应用于定量评估颗粒物(PM)对体外细胞的氧化性损伤。

细颗粒物的生物效应研究多是针对其中某些组分(如金属成分或有机提取成分)[5]进行毒性评价,不能全面反映PM2.5对机体的毒性效应；不同环境空气中的细颗粒物其组成成分是不同的,众多的大气污染物可联合作用于呼吸系统。部分组分的毒性评价不能完全准确反映细颗粒物对机体危害的总体效应,同时由于细颗粒物本身的特性及其吸附成分的复杂性,且每种组分的毒性机制又各不相同,因此即便是具有相同浓度的两份样品,其生物学效应可能差异很大。如何模拟细颗粒物的整体暴露试验来研究其综合毒性作用机制是目前颗粒物毒性测试的一个难点。

发光细菌毒性检测基于在一定实验条件下发光细菌发光强度恒定,毒性物质能抑制其正常代谢,导致其发光强度的减弱,毒性越强,对代谢的抑制作用越强。生物发光抑制原理是目前国际上研究较多的生物毒性检测技术之一,国际、国内均有相应的测试标准方法[9-17]。ISO11348-3费氏弧菌冻干法是目前比较成熟的发光细菌生物毒性测试方法,主要应用于饮用水、水体沉积物浸出液的急性毒性监测。与小鼠染毒、体外培养细胞毒性实验相比,发光细菌生物毒性检测方法具有样本量小,测试速度快的特点,每次测试仅需1 mL样本,可以采集每日颗粒物,样品直接超声提取后即开展毒性实验,减少了部分挥发性组分的损失。菌种复苏15 min即可开始实验,与样本接触15 min即可迅速得出实验结果,可同时测试出颗粒物各组分之间的协同、拮抗等综合毒性作用。为探索细颗粒物的简易快速毒性测试方法,我们研究应用费氏弧菌建立了PM2.5提取物的发光细菌的毒性测试方法,并对烟花爆竹燃放和沙尘污染天的PM2.5提取液进行了实样测试。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

MicroTox稀释液,MicroTox渗透压调节液,MicroTox补充液,实验用小玻璃试管,费氏弧菌冻干粉(批号13L4152)(美国Modern Water公司)。10～100μL可调节取样枪,100～1 000μL可调节取样枪(吉尔森)。苯酚标准溶液(标准号GSB07-1281-2000,批号102309,环保部标样所)。七水硫酸锌(分析纯,北京益利精细化学品有限公司)。

Microtox Model 500毒性检测系统(美国Modern Water公司),仪器配备了30孔温控培养室,温度控制在(15±0.5)℃；恒温调节温控菌种培养槽,温度控制在(5.5±1)℃；实验样品测试井,温度控制于(15±1.0)℃。

1.2 方法

1.2.1 样品采集方法

采用武汉天虹TH-16A型四通道采样器,应用2张石英膜和2张特富龙(46.2 mm,Whatman,PTFE)滤膜,以16.7 L·min-1的流量在车公庄地区连续进行采样,每12 h更换1张滤膜。样品采集前后,将滤膜放置在温度为25℃和相对湿度45%的恒温恒湿条件下平衡24 h,然后用精密度为0.01mg的Mettler A型天平测量采样前后的滤膜重量,获得PM2.5的质量浓度。

1.2.2 样品提取方法

将1 d 2个取样时段的2张特富龙滤膜放入一次性聚乙烯超声瓶中,加入相同体积高纯水,加盖密封,分别超声振荡10～60 min,溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后,部分提取液用于发光细菌毒性测试,其余提取液用于颗粒物可溶性组分分析。同时,将空白滤膜和超纯水分别放入超声瓶进行超声提取以进行对照实验。其余通道采样膜同步提取分析有机和无机组分。

1.2.3 发光细菌复苏前准备

将冻干细菌小瓶从-20℃的冷冻柜中取出,轻轻叩击瓶壁使冻干菌落入瓶底,回升温度到4℃左右。在恒温调节温控菌种培养槽的(5.5±1)℃孔中放置一个测试试管,如复苏小支菌粉,在管中加入1 mL MicroTox稀释液。如复苏大支菌粉,在管中加入1 mL MicroTox补充液,使其恒温保持在(5.5±1)℃。

1.2.4 样品测试准备

根据待测样品数量准备实验试管,插入温控培养室试管井中,A、C、E排试管用于待测样品,A1加入1 mL MicroTox稀释液作为对照,A2-A5、C1-C5、E1-E5管中加入1 mL待测样品和0.1 mL MicroTox渗透压调节液,混匀保持在(15±1)℃。

B、D、F排实验前每支试管内加入0.1 mL复苏好的发光菌悬浮液。

1.2.5 冻干菌粉复苏

在回升温度到4℃左右的菌粉瓶中加入(5.5±1)℃的稀释液或补充液,小包装菌粉每支加入0.3～0.4 mL稀释液,用旋涡混合器振荡混匀,置于(15±1)℃试管井复苏15 min开始实验,大包装菌粉每支加入1 mL MicroTox补充液混匀制成发光细菌浓缩液,使其恒温保持在(5.5±1)℃复苏5 min,实验时取浓缩菌液,按1:10比例用MicroTox稀释液稀释置于(15±1)℃试管井复苏15 min开始实验。

1.2.6 样品测试

Model 500毒性检测系统设置了不同的操作程序,按照仪器操作程序指示在发光菌复苏15 min后开始实验,先测试0.1 mL发光菌初始发光值,然后往每只菌液试管加入0.9 mL已恒温在(15±1)℃的稀释液或调整好渗透压的样品溶液,混匀,计时,然后测试发光强度的变化(见图1)。

图1 PM2.5提取液对发光细菌毒性试验流程图Fig.1 Flow chart of luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

1.2.7 质量控制方法

为保证实验结果准确可靠,每个样品均进行平行双样测试,结果取两者平均值,实验过程中:每批次测定时,应用菌种稀释液做空白及标准毒性参照物溶液同步测试以控制菌液质量；同时测试空白膜提取液和萃取用水的发光抑制率作为背景参考值,以判定样品提取液对发光细菌的发光抑制是否全部来自PM2.5(见图2)。

图2 PM2.5提取液对发光细菌毒性试验质量控制措施Fig.2 Quality control measures of luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

图3 PM2.5提取液对发光细菌毒性试验空白均值比较及质控样均值Fig.3 The comparison by mean luminous inhibition rate of blank sample and the average of the quality control sample in luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

2 结果(Results)

2.1 空白参照系的质量控制

共测试了26个批次的230个PM2.5膜提取液样本,在测试样本的同时测试了63个菌种稀释液空白、90个空白膜提取液、30个萃取用水空白样,73个毒性参照物样本。

各项空白的发光抑制率均控制在-10%～10%之间。稀释液空白均值为-2.70%±1.18%,萃取水空白均值为-1.93%±1.66%,膜空白均值为-1.05%± 1.36%。应用SPSS19进行均值T检验,3组空白值之间无显著差异(P＜0.05)。说明样品提取液对费氏弧菌产生的发光抑制均来自颗粒物样本。各空白均值比较见图3。

2.2 标准毒性参照物的质量控制

26批次实验所带毒性参照物分别为10mg·L-1、16mg·L-1、20mg·L-1的七水硫酸锌和70mg·L-1的苯酚溶液。70mg·L-1的苯酚溶液发光抑制率均值为70.9%±1.21%,10mg·L-1七水硫酸锌发光抑制率均值为88.4%±1.03%,16mg·L-1七水硫酸锌发光抑制率均值为92.3%±6.17%,20mg·L-1七水硫酸锌发光抑制率均值为94.2%±0.56%,结果相对稳定,表明样品测试结果稳定可靠。

实验中为保证菌种质量,在更换每批次的菌液时,重新绘制标准毒性参照物曲线。全部实验过程中共绘制了8条苯酚曲线、5条硫酸锌曲线,苯酚曲线的相关系数值分别为 0.9809、0.9968、0.9848、 0.9950、0.9839、0.9884、0.9854和0.9915,苯酚的EC50分别为31.4、27.7、27.7、23.8、24.6、22.9、22.9和29.0mg·L-1,硫酸锌曲线的相关系数值分别为0.9721、0.9841、0.9391、0.9581和0.9762,硫酸锌的EC50分别为1.95、2.86、3.83、4.04和3.56mg·L-1,符合方法规定要求。

图4 春节期间PM2.5主要组分浓度与月平均值比较Fig.4 The comparison of the concentrations of the component of PM2.5between the Spring Festival and monthly average

2.3 实样测试结果

2.3.1 烟花爆竹燃放物的生物效应

针对烟花爆竹产生的污染,选取了2014年2月春节期间样品开展的颗粒物提取液毒性实验表明:烟花爆竹产生的PM2.5对费氏弧菌的发光具有明显的抑制作用。春节期间,除夕和元宵节为2次较为集中的烟花爆竹的燃放时段,烟花爆竹集中燃放时段的PM2.5中NO-3、SO2-4、微量金属元素等组分增加明显,其中微量金属元素浓度水平是平时的11倍(见图4),烟花爆竹燃放过程中产生的微量元素中主要以K、Cl-、Mg为主,Cl-是月均值的3～4倍,K、Mg分别是月均值的10～12倍(见图5)。2月14、15、16日3 d的样品提取液发光抑制率值均在30%以上,对费氏弧菌的发光产生明显抑制作用,特别是15日(元宵节)PM2.5提取液的发光抑制率达37.3%,为当月最高值,应用SPSS19,将颗粒物提取液发光抑制率与PM2.5日均值浓度以及同步采样分析的得到的PM2.5微量金属元素、NO-3、SO2-4浓度进行皮尔逊相关性分析,每日样品提取液的发光抑制率值与PM2.5日均值浓度显著相关(相关系数:0.767,P＜0.01,n= 24),发光抑制率值与微量金属元素、总有机物(OM)、NO-3、SO2-4等有毒有害组分浓度同样显著相关(相关系数分别为:0.784、0.769、0.767、0.759,P＜0.01, n=24)。可溶性提取液中微量元素K+、Cl-、Mg2+浓度与发光抑制率值的相光系数分别为0.747、0.770、0.639,P＜0.01,n=24。Charrier和Anastasio[5]研究加利福尼亚圣华金河谷PM2.5对DTT氧化效应时发现,大约80%的DTT氧化损失来自于样品中金属组分。说明细颗粒物(PM2.5)中微量金属组分的影响不容忽视。

图5 春节期间PM2.5主要微量元素组分浓度日变化趋势Fig.5 The daily variation trend of composition concentration of the component trace element of PM2.5during Spring Festival

Liu等[3]研究北京城区和郊区PM2.5样品DTT氧化损失和活性氧产生能力并解析了不同来源组分与活性氧产生能力的关系,发现二次来源的颗粒组分、Zn、Al、Pb、Fe和沙尘源颗粒组分是引起细胞氧化损伤和产生炎性因子重要因素。我们的分析中,春节时段二次来源的NO-3、SO2-4(相关系数:0.769、0.767),微量金属中的Pb、Cd、Mn、Se、Cu、As、Zn等组分浓度与发光抑制率同样相关(相关系数分别为: 0.827、0.802、0.754、0.731、0.730、0.583,0.569,P＜0.01,n=24)。与他们结果不同,我们发现Al、Fe这些代表地壳元素的组分浓度与发光抑制率显著不相关(地壳元素相关系数:0.219,P＞0.05,n=24)。产生这一差异的原因可能是供试实验物种以及样品采集季节不同导致的组分浓度差异造成的。

2.3.2 沙尘污染的生物效应

2014年非采暖季北京共发生13 d局地扬尘或外来沙尘污染,其PM2.5浓度为50～121μg·m-3,样品提取液均未检出对发光细菌的明显抑制效应,与非沙尘天相同浓度提取液相比,低浓度PM2.5对发光细菌的光抑制效应差别不大,随着PM2.5浓度增加,非沙尘天样品提取液对发光细菌的光抑制效应略高于沙尘天样品(见表1,明显抑制作用判定标准:发光抑制率＞20%)。应用SPSS19,将2014年1～10月发光抑制率值与提取液中地壳元素浓度进行皮尔逊相关性分析,结果表明:样本提取液中地壳元素浓度和发光抑制率值显著不相关(相关系数为:0.123,P＞0.05,n=159)。中国矿业大学邵龙义等[24]应用DNA质粒评价法开展的颗粒物生物效应实验发现:沙尘暴期间大气颗粒物的氧化性损伤低于非沙尘暴样品。Schwartz等[26]对美国六城市的流行病学调查也发现以地壳元素为主的细粒子与总死亡率没有相关性,与我们实验结果不同,Liu等[3]2012年观察到北京郊区PM2.5样品中地壳元素组分对DTT氧化损失的贡献占47%。我们实验样品取自城市中心区,城区样品PM2.5组分与郊区样品组分存在一定的差异。Wang等[2]研究北京不同粒径的颗粒物特点时发现,随着粒径的增大,地壳元素的浓度增加,地壳元素主要集中在粗颗粒(PM2.5-10)中。北京空气质量指数AQI_PM2.5历史数据显示:沙尘发生时段,PM10日均值浓度增加较多。Wang等[2]体外细胞毒性实验显示:相同颗粒物对不同的细胞系产生炎性因子的影响差异较大,范兰兰等[21]在实验中发现相同剂量的颗粒物对不同细胞的生物效应存在差异,黄雪莲等[23]观察到PM10对巨噬细胞分泌炎性因子的作用大于PM2.5。发光细菌毒性测试结果与Liu等[3]实验结果的差异可能缘于颗粒物来源、实验物种以及的取样地点和实验方法的差异造成的。

表1 2014年沙尘污染天PM2.5样品发光抑制率统计表Table 1 The luminous inhibition rate of PM2.5samples from the dust pollution days during 2014

2.3.3 与其他细胞水平毒性实验结果的比较

按照膜的称重结果,计算提取液的浓度,按照样品发光抑制率＞20%为样品对费氏弧菌发光具有显著抑制效应的判定标准。统计得到:样品发光抑制值＞20%的样本提取液的浓度,介于14.2μg·mL-1～186μg·mL-1之间,并呈浓度效应关系(r=0.3619,P＜0.05,n=225,见图6)。由于PM2.5样本取自一年中不同的季节,受气象因素和不同季节污染排放源的变化影响,相同质量浓度样本各季节的组分的差异较大,导致相同质量浓度样品在不同季节的发光抑制率差异较大,从而削弱了PM2.5提取液质量浓度与发光抑制的效应关系,但随着PM2.5提取液质量浓度增加,仍可观察到发光抑制率增加的趋势。郑灿军等[8]曾分别提取石英膜上全颗粒组分、水溶性成分、有机成分和不溶成分,得到PM2.5全颗粒物中水溶性成分、有机成分分别占65.1%,19.7%,不溶性成分为15.2%。按这个比例估算:对费氏弧菌发光具有明显抑制的可溶性提取液样本的浓度大约为:9.22μg·mL-1～121μg·mL-1。龙放等[18]应用PM2.5与肺上皮MLE-12细胞进行实验,实验观察到浓度为100和200μg·mL-1的PM2.5溶液暴露处理肺上皮MLE-12细胞24 h,细胞存活率明显降低,分别降低28%和33%(P＜0.01)；浓度为25～200μg·mL-1的PM2.5溶液暴露处理细胞48 h,细胞存活率均明显下降(P＜0.01),并呈浓度效应关系(r=0.4940,P＜0.01)。我们的实验中,对费氏弧菌发光产生明显抑制的样品提取液浓度低于上述实验,与其他颗粒物体外细胞毒理学[19-21]实验相比,这些实验中对细胞产生毒理效应的浓度范围比对费氏弧菌发光产生明显抑制效应的浓度稍高,表明费氏弧菌对颗粒物的影响比较敏感。

图6 PM2.5提取液浓度与发光抑制率的相关性曲线Fig.6 The correlation between PM2.5extracting solution concentration and luminous inhibition rate

本文提出的PM2.5提取液生物效应的测试方法和实样测试结果表明:(1)PM2.5提取液的发光细菌毒性测试方法是一种综合毒理效应敏感、简便易实施的颗粒物的生物效应暴露试验方法。研究提出的测试方法可行有效、质控措施严谨,具有操作简单快速,易于应用推广的特点,可在1 h内测试出颗粒物各组分之间的协同、拮抗等综合生物毒性。(2)实样测试表明:PM2.5提取液中微量金属元素等有毒有害组分浓度与发光抑制率值显著相关(相关系数为: 0.784,P＜0.01,n=24),地壳元素浓度与发光抑制率值显著不相关(相关系数为:0.123,P＞0.05,n=159)；(3)与其它细颗粒物细胞毒性实验方法相比,具有相近的实验灵敏度。

通过有效的质量控制手段可以获得具有可比性的每日细颗粒物提取液的发光抑制率值,建立起每日细颗粒物浓度与发光抑制效应结果之间的关系,并能够进一步分析生物效应与颗粒物各组分日平均浓度之间的相关性,解析PM2.5来源。建议将实验方法应用于PM2.5日常监测中,逐步建立起生物效应动态评估背景数据库,为大气污染治理提供参考。

虽然烟花爆竹引起的重污染天持续时间不长,但其在短时间内排放的含有大量有毒有害物质的PM2.5不仅造成了感官上的空气质量污染,而且对费氏弧菌的发光抑制作用明显增加,危害很大,建议从多角度宣传烟花爆竹燃放排放对人体健康的危害,提倡科学的生活、过节方式,尽量减少烟花爆竹燃放。

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Application of Luminescent Bacteria in the Acute Toxicity Test of the Water-Soluble Constituents of PM2.5

Sun Chenghua1,2,Shi Aijun1,2,*,Liu Baoxian1,2,Zhang Dawei1,2,Chen Tian4,Liu Jianwu3,Liu Kang1,2,Zhou Jiannan1,2,Hong Shanshan1,2
1.Beijing Municipal Environmental Monitoring Center,Beijing 100048,China
2.Beijing Key Laboratory of Airborne Particulate Matter Monitoring Technology,Beijing 100048,China
3.The College of Nuclear Science and Technology of Beijing Normal University,Beijing 100875,China
4.Beijing Environmental Protection Agency,Beijing 100048,China

26 May 2015 accepted 20 July 2015

The fine particulate matter(PM2.5)can be breathed into lungs and threatens human health.For scientific assessment of the comprehensive biological effects of PM2.5,a simple method with the laboratory quality control standards for testing the toxicity of the PM2.5water-soluble components was established by usingVibrio fischerias an indicator bacterium.A series of toxicity tests performed on this luminescent bacterium were carried out with thePM2.5samples from the Spring Festival fireworks and the dust pollution,respectively.Our results showed that the luminous inhibition rate had a significant correlation with the concentrations of poisonous and harmful trace metal elements discharged by the fireworks and crackers during the Spring Festival,whereas the luminous inhibition rate was not associated with the concentrations of the earth’s crust elements in the PM2.5extracting solution.

luminescent bacteria;bio-toxicity test;luminous inhibition rate;fine particulate matter

2015-05-26 录用日期:2015-07-20

1673-5897(2016)1-353-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150526001

孙成华,石爱军,刘保献,等.基于发光细菌的细颗粒物(PM2.5)可溶性提取液综合生物效应测试方法及其应用[J].生态毒理学报,2016,11(1):353-361

Sun C H,Shi A J,Liu B X,et al.Application of luminescent bacteria in the acute toxicity test of the water-soluble constituents of PM2.5[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):353-361(in Chinese)

北京市环境保护监测中心自筹经费课题(2014-017)

孙成华(1969-),女,学士,高级工程师,研究方向为环境生物监测,E-mail:sunchenghua@bjmemc.com.cn

),E-mail:cems@bjmemc.com.cn

简介:石爱军(1972-)，男，硕士，教授级高工，研究方向为环境监测。