5种卤代乙酰胺类消毒副产物对小鼠淋巴瘤细胞Tk基因致突变性研究

袁婷婷，王新亮，董慧峪

1.北京医院检验科，北京100730

2.天津市城市规划设计研究院，天津300201

3.中国科学院生态环境研究中心，北京100085

5种卤代乙酰胺类消毒副产物对小鼠淋巴瘤细胞Tk基因致突变性研究

袁婷婷1，王新亮2，董慧峪3,*

1.北京医院检验科，北京100730

2.天津市城市规划设计研究院，天津300201

3.中国科学院生态环境研究中心，北京100085

卤代乙酰胺类(HAcAm)消毒副产物(DBPs)是饮用水中新兴含氮类DBPs之一。为探究HAcAms的致突变性,选择小鼠淋巴瘤细胞作为受试细胞,分别考察了一氯代乙酰胺、二氯代乙酰胺、三氯代乙酰胺、一碘代乙酰胺、二碘代乙酰胺(DIAcAms)共5种HAcAms对小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变的影响。结果表明,在0.05～20μmol·L-1暴露浓度下,5种HacAms类DBPs对小鼠淋巴瘤细胞呈现出一定的细胞毒性,随着暴露浓度的升高,细胞毒性增强。暴露4 h后,5种HacAms中只有DIAcAms呈现出显著的致突变性(暴露剂量高于5μmol·L-1),且以小集落为主。上述研究结果为研究HacAms对哺乳动物细胞的致突变作用提供了基础数据。

卤代乙酰胺；小鼠淋巴瘤细胞；突变分析

饮用水消毒副产物(DBPs)是饮用水加氯消毒过程生成的微量污染物。部分DBPs对人或哺乳动物具有致癌、致畸形、致突变“三致”作用,三者之间紧密联系,其中突变包括基因突变和染色体畸变,是癌症和畸形产生的重要危险因素。基于DBPs在饮用水中检出率、检出水平和毒理学研究结果,世界卫生组织、美国环境环保署分别对饮用水中的14种、11种DBPs提出限量控制要求,我国《生活饮用水卫生标准》也将13种DBPs纳入控制范围(包括三卤甲烷类、卤乙酸类、卤酸盐、卤乙腈等)。近年来随着污染物解析技术的发展和毒理学研究的深入,发现未受控DBPs可能对人体健康造成危害的风险更大,由此未受控DBPs日益受到关注。

作为一种新型的卤代含氮DBPs,卤代酰胺类(HAcAms)DBPs已在欧美国家得到广泛重视[1]。一氯乙酰胺(CAcAm)、一溴乙酰胺、二氯乙酰胺(DCA-cAm)、二溴乙酰胺和三氯乙酰胺(TCAcAm)均已在美国饮用水出厂水中检出,最高浓度可达几十μg·L-1[2]。已有毒理学研究表明,HAcAms的细胞毒性是卤乙酸(HAAs)的102倍左右,遗传毒性是HAAs的20倍左右[3],HAcAms细胞毒性显著高于受控类三卤甲烷(THMs)、HAAs,然而HAcAms对哺乳动物细胞的毒性与致突变性尚未有文献报道,开展HAcAms对哺乳动物细胞突变的研究对全面了解其“三致”风险,保障人民群众安全用水具有重要的意义[4-5]。

小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验是一种具有较高的检出灵敏度、较广的检测谱且简便易行的体外短期致突变试验方法[6]。该方法可检出发生于Tk位点的点突变、小缺失,同时还能检出包括Tk位点在内的大缺失、易位、重组甚至染色体非整倍性等广泛的遗传学改变。欧美国家均已将其列为一组必选的遗传毒性测试,我国亦将其列为保健食品、药品、化妆品等安全性毒理学评价中的必选实验之一。本研究采用小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验检验5种HAcAms类DBPs的致突变性,为水体中HAcAms类DBPs引起的健康风险提供毒理学依据,同时亦可为Tk基因突变试验检验在水体中微量污染物风险评估中的应用积累数据资料。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验用小鼠淋巴瘤细胞L178Ytk+/-3.7.2C由日本国立卫生研究所提供。5种受试HAcAms详细信息如表1所示。实验用阳性对照甲磺酸甲酯(MMS,98%)购自Sigma Aldrich(美国)公司,二甲基亚砜(DMSO,99%)购自中国国药有限公司。

表1 5种卤代乙酰胺类消毒副产物(DBPs)信息Table 1 Detailed information of the five investigated haloacetamides(HacAms)

表2 5种卤代乙酰胺类DBPs的毒性与致突变性Table 2 Toxicity and mutagenicity of five HAcAms in mouse lymphoma cells

1.2 实验方法

基础培养基(RPMI-0)由RPMI 1640中添加200 g·mL-1丙酮酸钠,100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素；处理用培养基(RPMI-5)、常规培养用培养基(RPMI-10)和集落生长用培养基(RPMI-20)分别有基础培养基入5%、10%或20%的马血清(56℃、30 min灭活)制成。L5178Y细胞液氮下保存,复苏后常规开放式悬浮培养于RPMI-10,在37℃、5%CO2条件下培养至稳定的对数增长状态,细胞密度维持在1×106·mL-1以下,使用时传代不应超过10代。在与正式试验相同条件下处理细胞,表达培养2 d后测定相对悬浮增长率(relative suspension growth, RSG)。在20%～100%RSG范围内以等比或等差设定4个剂量。另设溶剂对照(DMSO)和阳性对照(MMS,10μg·mL-1)。受试物处理细胞用RPMI-5调整细胞密度为106·mL-1(每组20mL)。按1%体积加入受试物、溶剂对照或阳性对照,振荡处理4 h。处理结束后,1 000 r·min-1离心5 min,弃上清液,用PBS洗涤细胞一次,重悬于RPMI-10中,并调整细胞密度至2×105·mL-1。

d0平板接种效率(plating efficiency,PE0):将处理后的细胞用RPMI-20梯度稀释至8个·mL-1,25 mL(阴性对照为50 mL)。以200μL·孔-1(1.6个细胞·孔-1)接种到一块96孔培养板(阴性对照接种2块)。培养12 d后计数每块培养板有集落生长的孔数。d2平板接种效率(plating efficiency,PE2):剩余细胞作表达培养2 d。每天计数细胞密度,调整至2×105·mL-1,并计算每日细胞增长率(daily cell growth, DCG),据此求算2 d内RSG。PE2接种方法同PE0。

TFT抗性突变频率(mutant frequency,MF)的测定:表达培养结束后,取适量细胞,用RPMI-20调整密度至1×104·mL-1,50 mL(阴性对照组为100 mL),加入三氟胸甘(TFT),使其浓度为2μg·mL-1。以200μL·孔-1(2 000个细胞·孔-1)接种2块96孔培养板(阴性对照组接种4块)。培养12 d后分别计数含有大集落(large colony,LC)的孔数、只含小集落(small colony,SC)的孔数、同时含有LC和SC的孔数。大小集落的区分标准:LC大小超过每孔直径的1/4,呈薄层分布；SC大小在每孔直径的1/4以下,呈块状,结构致密。

1.3 数据统计与分析

数据统计分析使用SPSS 19.0(IBM,USA)进行。采用ANOVA方法分析HAcAms暴露组与空白对照组之间的差异,P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

图1 不同HAcAms剂量作用下Tk基因总突变频率及小集落相对含量Fig.1 Effect of HAcAms dose on the mutant frequency ofTkgene and relative amount of small colony

2 结果(Results)

2.1 细胞毒性

当HAcAms的暴露剂量高于50μmol·L-1时,部分RTG低于本测试方法最低限定值(20%)[7],因此本文中5种HAcAms的暴露剂量均控制在0.05～20μmol·L-1范围内。如表2所示,小鼠淋巴瘤细胞相对悬浮生长率(RSG)、RTG均随着HAcAms剂量的增大而降低。当CAcAm、DCAcAm、TCAcAm、IA-cAm、DIAcAm的剂量为20μmol·L-1时,小鼠淋巴瘤细胞的RSG分别为55%、53%、58%、47%、41%, RTG值分别为48%、42%、35%、38%、28%,显示出较强的细胞毒性,其中IAcAm、DIAcAm的RSG、RTG值均低于氯代 HAcAms的值,表明碘代HAcAms的细胞毒性高于氯代HAcAms。

2.2 5种HAcAms作用下Tk基因总突变频率及小集落相对含量

5种HAcAms作用下Tk基因总突变频率及小集落相对含量变化如表2、图1所示。MMS阳性对照的结果表明,当MMS暴露剂量为10μg·mL-1Tk基因总突变频率显著提升且具有统计学意义(P＜0.001)。随着5种HAcAms暴露剂量的增大,Tk基因总突变频率均呈现出升高的趋势。但只有DIA-cAm暴露剂量达到5μmol·L-1、20μmol·L-1时,Tk基因总突变频率与溶剂对照差异才呈现出统计学意义(P＜0.05),其诱发突变频率分别达到自发突变频率的4倍及9倍。对DIAcAm各暴露剂量与总突变频率做线性关系回归分析,有较好的剂量响应关系(P＜0.05)。在观察到大集落(LC)、与小集落(SC)2种表型的突变集落中,小SC的丰度多高于LC丰度。其中DIAcAm暴露剂量为5μmol·L-1、20μmol·L-1时,SC的相对丰度可分别达到 60.14%、67.14%,与Liviac等[8]观测到DBPs暴露下小鼠淋巴瘤细胞大小集落丰度分布结果一致。

3 讨论(Discussion)

饮用水中DBPs的长期暴露可能带来的健康风险已成为饮用水安全保障的研究热点之一。已有流行病学的研究调查了DBPs长期暴露与癌症、生殖健康状况(先天性畸形、死胎、流产、出生体重、成熟度和精液质量)等的关联情况[9-11]。其中已发现了DBPs的浓度水平与膀胱癌发病概率的相关性,但生殖健康与DBPs的关联尚未有定论[13]。本文采用哺乳动物细胞为受体细胞,考察了5种HAcAms暴露下的Tk基因总突变频率,发现5种HAcAms均呈现出一定的细胞毒性,其中DIAcAm具有统计学意义的致突变性。在高剂量(20μmol·L-1)暴露下, Tk基因总突变频率为DIAcAm＞IAcAm＞CAcAm＞TCAcAm≈DCAcAm,Plewa等[14]曾报道过13种HAcAms的慢性细胞毒性(以中华仓鼠卵巢细胞为受体),其中DIAcAm＞IAcAm＞CAcAm＞DCA-cAm＞TCAcAm,与本文毒性水平分布总体一致。

MX(3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2 (5H)-furanone)是一种氯化呋喃酮类物质,美国、英国、日本、中国均从氯化消毒的自来水中检出MX[15]。尽管MX在氯化饮水中浓度一般为在几十个ng·L-1级别,但可占氯化饮水有机提取物总诱变性的50%左右[16]。本研究根据美国环境保护署基于QSAR计算的T.E.S.T.数据库中的5种HAcAms与MX的致突变数据进行比较,所得相对毒性数据如图2所示。其中DIAcAm的相对致突变性最高(0.87),CAcAm最低(0.39),总体趋势与本文实验结果相一致。

碘代DBPs的细胞毒性与遗传毒性通常均高于氯代DBPs与溴代DBPs[17],本文研究结果发现碘代HAcAms的致突变性显著高于氯代HAcAms,进一步证实了碘代DBPs的高“三致”作用。已有研究证明,滤后水中的碘离子、含碘微量有机物及食盐中的碘离子均有可能成为碘代DBPs的碘源,进而生成高毒性碘代DBPs[18][19]。饮用水中碘代DBPs的生成规律、浓度分布及毒性评估需引起足够重视,以有效控制其带来的饮用水健康风险。

图2 基于QSAR计算的5种HAcAms致突变相对值(数据源自USEPA T.E.S.T.数据库，以3-氯-4 -(二氯甲基)-5-羟基-2(5H)-呋喃(MX)为基准物)Fig.2 Mutagenicity of five HAcAms based on the calculation of QSAR (Relative mutagenicity value is calculated using USEPA T.E.S.T. database values and 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone is selected as the reference compound).

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Mutagenic Analysis of Five Haloacetamides Disinfection By-products in the Tk Gene of Mouse Lymphoma Cells

Yuan Tingting1,Wang Xinliang2,Dong Huiyu3,*
1.LaboratoryDepartment,Beijing Hospital,Beijing 100730,China
2.Tianjin Urban Planning&Design Institute,Tianjin 300201,China
3.ResearchCenter for Eco-environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China

30 November 2015 accepted 11 January 2016

Haloacetamide(HAcAm)is one of the emerging nitrogeneous disinfection by-products(DBPs)in drinking water.To evaluate the mutagenic potential of HAcAm,effects of 5 HAcAms including chloroacetamide,dichloroacetamide,trichloroacetamide,iodoacetamide and diiodoacetamide(DIAcAm)on thymidine kinase(Tk)gene in the well-validated mouse lymphoma assay were investigated in this study.The results showed that with the exposure levels from 0.05 to 20μmol·L-1,all the 5 HAcAms investigated exhibited cytotoxicity,which increased with the elevated exposure level.After 4 h of exposure,only DIAcAm increased the frequency of mutant colonies,with a higher proportion of small colonies.These results of HAcAms provided basic data for the evaluation of mutagen-ic potential to mammalian cells.

haloacetamide;mouse lymphoma cells;mutation assay

2015-11-30 录用日期:2016-01-11

1673-5897(2016)1-153-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151130022

袁婷婷,王新亮,董慧峪.5种卤代乙酰胺类消毒副产物对小鼠淋巴瘤细胞Tk基因致突变性研究[J].生态毒理学报,2016,11(1):153-158

Yuan T T,Wang X L,Dong H Y.Mutagenic analysis of five haloacetamides disinfection by-products in theTkgene of mouse lymphoma cells[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):153-158(in Chinese)

国家自然科学基金课题(51408590)

袁婷婷(1985-),女,检验医师,研究方向为细胞生物毒理学,E-mail:ttyuan.ok@163.com；

),E-mail:hydong@rcees.ac.cn

简介:董慧峪(1983-)，男，环境工程博士，助理研究员，主要研究方向水体安全消毒与输配，发表学术论文10余篇。