氯胺酮诱导小鼠脑皮质神经细胞的凋亡及其机制

肖 莉 陈 靖 盛崴宣 冯 枫 陈立芳

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038)



氯胺酮诱导小鼠脑皮质神经细胞的凋亡及其机制

肖 莉 陈 靖 盛崴宣 冯 枫 陈立芳

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038)

目的 探究氯胺酮诱导脑皮质神经细胞的凋亡及其机制。方法 分别用30、60、80、100 mg/ml氯胺酮分别处理小鼠脑皮质神经细胞6、12、18、24 h，采用MTT法检测氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞的凋亡率；用100 mg/ml氯胺酮不用时间处理小鼠皮质神经细胞，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测处理前后皮质神经细胞LDH释放率的变化；将不同处理后的神经细胞进行总蛋白提取，Western印迹法检测GSK-3β蛋白的表达；用100 mg/ml氯胺酮处理后的小鼠皮质神经细胞18 h后采用流式细胞仪检测处理后皮质神经细胞的凋亡。结果 30 mg/ml的氯胺酮处理6 h，细胞的凋亡率仅为(12.4±2.47)%，对照组没有出现细胞凋亡，随着浓度的增加和作用时间的延长，凋亡率逐渐增加；100 mg/ml氯胺酮处理24 h时小鼠神经细胞的抑制率达到最大值为(58.7±5.86)%。100 mg/ml的氯胺酮不用时间处理皮质神经细胞后LDH释放率与氯胺酮作用时间呈正相关，其中18 h释放率较大，24 h皮质神经细胞的LDH释放率为(192±4.39)%，在6～24 h达到最大，约为6 h处理的1.8倍。6 h GSK-3β蛋白表达量升高，约为对照组的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表达量呈现较低水平为(118.7±3.56)%，18 h表达量明显升高为(144.7±3.72)%，24 h为对照组的(197.3±4.36)%。与对照组相比，氯胺酮处理后的皮质神经细胞出现了大量的凋亡。结论 高剂量氯胺酮能够诱发小鼠脑皮质神经细胞凋亡，可能与GSK-3β蛋白激活相关。

氯胺酮；皮质神经细胞；GSK-3β

全身麻醉是现代手术治疗的辅助手段，可以减轻患者对手术的恐惧和痛苦〔1〕，但长期使用麻醉会对人的大脑神经系统产生一定的影响〔2〕。氯胺酮作为临床上经常使用的麻醉剂，镇痛效果极佳，体外组织培养实验表明长期使用氯胺酮会诱导细胞凋亡，严重者导致神经衰退〔3〕。本文研究氯胺酮作用于皮质神经细胞后对乳酸脱氢酶(LDH)及GSK-3β表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试剂 体重约80 g的小鼠，由首都医科大学实验室饲养。B27培养基、DEME、双抗、FBS，美国Gibco公司；胰酶、DMSO、Annexin-FITC、Propidiuym Iodide，Sigma公司；MTT，上海谱振生物科技有限公司；pierce-膜蛋白提取试剂盒，上海伟进生物科技有限公司；GSK-3β抗体，CST公司；LDH检测试剂盒，碧云天生化科技有限公司；羊抗兔抗体，北京诺博莱德科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠神经细胞的培养 在超净台将小鼠的头部用酒精消毒后，有手术刀切断小鼠头部，用无菌剪刀剪开小鼠头部，小心取出小鼠的脑部，置于磷酸盐缓冲液(PBS)中，去除表面血管，将皮质部分用剪刀剪成块状，加入0.25%的胰液中，37℃温育10 min，反应终止后，将悬浮液800 r/min离心5 min，弃去上清，加入DEME培养液清洗细胞，800 r/min离心5 min，弃去上清后加入DEME培养液培养细胞37℃ 5%CO2，培养1 d后，离心后弃去上清培养液加入B27培养基，每2 d更换1次培养液，第6天时加入药物进行处理。

1.2.2 MTT法检测氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞的凋亡率 在已经培养6 d的细胞中加入氯胺酮进行处理小鼠皮质神经细胞，药物浓度30、60、80、100 mg/ml，分别处理6、12、18、24 h。对照组为不加氯胺酮的神经细胞加入PBS溶液培养，实验组加入20 μl MTT，室温下反应4 h后，800 r/min离心3 min，弃去上清，加入200 μl DMSO，室温反应10 min，540 nm下进行OD值测定，公式：凋亡率=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%。

1.2.3 氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞LDH释放率 采用LDH试剂盒进行测定，在96孔细胞培养板内加入50 μl LDH底物，50 μl 不同处理的细胞上清液，黑暗下反应30 min，490 nm下测定吸光值为细胞上清中LDH释放量。向原96孔板内加入溶解酶，37℃反应1 h，取50 μl 细胞反应液，加入50 μl LDH底物，避光反应30 min后，490 nm测定吸光值为神经细胞总LDH释放量，细胞LDH释放率=OD上清/OD总。

1.2.4 Western印迹法检测GSK-3β蛋白的表达 将不同处理后的神经细胞离心后收集，参照细胞总蛋白提取试剂盒提取蛋白，在蛋白核酸分析仪上测定提取蛋白的浓度，取同等蛋白量20 μg，加入上样缓冲液100℃变性失活，配制10%分离胶、4%浓缩胶，样品进入浓缩胶电压为80 V，进入分离胶后调电压140 V，电泳结束后，将蛋白凝胶在NC膜 4℃进行转膜，过夜反应后，加入脱脂牛奶4℃下封闭，取出PVDF膜，PBS 溶液清洗后加入一抗鼠抗GSK-3β，4℃孵育过夜，加入Tris盐酸缓冲液(TBST)清洗3次，每次约10 min，加入稀释后的标记羊抗兔抗体室温下反应1 h，加入TBST清洗3次，每次约10 min。将PVDF膜放入凝胶成像仪中，保存图片。

1.2.5 流式细胞仪检测氯胺酮处理后皮质神经细胞的凋亡 将用100 mg/ml氯胺酮处理后的小鼠皮质神经细胞18 h，对照组细胞加入DMSO溶液，反应结束后用PBS溶液清洗细胞，800 r/min离心后细胞沉淀，加入Annexin-FITC和Propidiuym Iodide混匀，避光培养15 min，在流式细胞仪上检测神经细胞凋亡。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件行t检验，Pearson法进行相关性分析。

2 结 果

2.1 MTT法测定氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞的凋亡率 30 mg/ml的氯胺酮处理6 h，细胞的凋亡率仅为(12.4±2.47)%，对照组没有出现细胞凋亡；随着作用时间的延长，凋亡率逐渐增加，60 mg/ml组处理后的神经细胞凋亡率高于30 mg/ml；当氯胺酮浓度为100 mg/ml、处理时间为24 h，小鼠神经细胞的抑制率达到最大值为(58.7±5.86)%，神经细胞的凋亡率与氯胺酮的作用时间、浓度呈依赖关系。见表1。

表1 氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞的凋亡率

与30 mg/ml组相比:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞LDH释放率 未经氯胺酮处理的小鼠皮质神经细胞的LDH释放率为100%，并且不随作用时间的变化而变化。与对照组相比，氯胺酮作用后的神经细胞LDH释放率升高，与氯胺酮作用时间呈正相关，6 h皮质神经细胞LDH释放率为(115±5.27)%,18 h释放率变化较大为(121±4.26)%，此时氯胺酮开始高效发挥其诱导细胞凋亡的作用，18 h LDH释放率为(160±5.28)%；24 h LDH释放率为(192±4.39)%。

2.3 Western印迹法检测GSK-3β蛋白的表达 6 h组与对照组相比GSK-3β蛋白表达量升高，约为对照组的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表达量呈现较低水平为(118.7±3.56)%，18 h表达量明显升高为(144.7±3.72)%，24 h为(197.3±4.36)%，加入氯胺酮处理皮质神经细胞6～24 h内，GSK-3β蛋白活性被激活。见图1。

2.4 流式细胞仪检测氯胺酮处理后皮质神经细胞的凋亡 与对照组未经氯胺酮处理的皮质神经细胞相比，处理后的皮质神经细胞出现了大量的凋亡，表明氯胺酮能够诱导皮质神经细胞的凋亡。见图2。

图1 氯胺酮不同时间处理后GSK-3β蛋白表达

图2 流式细胞仪检测氯胺酮处理后皮质神经细胞的凋亡

3 讨 论

氯胺酮是临床上经常使用的全身麻醉剂，它能够使交感神经保持正常的功能，对循环、呼吸系统也有一定的保护作用，其主要作用机制是通过抑制神经递质的传递及其与NMDA受体作用，从而发挥全身麻醉的效果〔4〕。有研究表明大剂量使用氯胺酮能够使小鼠神经细胞发生凋亡，严重影响后天的认知学习功能〔5〕。机体神经系统的发育过程中细胞的凋亡属于维持机体平衡，但是神经系统的病变则会加速神经细胞的凋亡〔6〕。本研究选取了氯胺酮的4个浓度30、60、80、100 mg/ml，结果显示氯胺酮对皮质神经细胞的诱导加速，细胞的凋亡率升高。氯胺酮的浓度为80 mg/ml时，细胞的染色体已经严重变形〔7〕，因此本实验对出生1 w左右的大鼠加大了药物浓度，结果表明在100 mg/ml氯胺酮小鼠皮质神经细胞的凋亡率高于80 mg/ml。高浓度的氯胺酮能够严重影响小鼠大脑皮质神经细胞的凋亡。

LDH是机体糖酵解过程中的一种酶，广泛存在于机体内参与正常的生理代谢，组织发生病变或者遭到破坏时细胞内的LDH渗出，导致细胞基质中LDH含量升高，因此LDH是检测机体代谢的最敏感的指标〔8〕。本文结果显示，氯胺酮处理后小鼠皮质神经细胞LDH释放率升高，18 h氯胺酮开始高效发挥其诱导细胞凋亡的作用，24 h皮质神经细胞的LDH释放率达到最大。

GSK-3β是广泛分布在脑组织中的一类丝氨酸类蛋白激酶，参与神经传递过程中的信号传递〔9〕。研究表明GSK-3β蛋白参与神经细胞诱导凋亡，关于GSK-3β参与大脑皮质神经细胞诱导凋亡的报道较少，神经细胞受损后GSK-3β蛋白结构中的Ser9发生去磷酸化，GSK-3β被激活进而调节神经信号传导中其他相关应答基因的表达〔10〕。倪锦〔11〕研究表明氯胺酮能够诱导乳鼠皮质神经细胞凋亡主要是通过激活GSK-3β活性发挥作用〔11〕。本实验发现，加入氯胺酮处理皮质神经细胞6～24 h，GSK-3β蛋白活性被激活。

高剂量氯胺酮能够导致幼鼠脑细胞的凋亡，神经系统内细胞凋亡是机体维持正常生理活动的正常现象，但受损或病变的神经细胞则会出现异常凋亡，进而影响脑部神经的正常生理功能〔12〕。本研究中100 mg/ml氯胺酮作用小鼠脑皮质神经细胞24 h后流式细胞仪检测，结果表明处理后的神经细胞出现大量凋亡，这一结果与之前测定的细胞凋亡率升高相符合，表明氯胺酮能够诱导脑细胞大量凋亡。

综上所述，本实验证明高剂量氯胺酮能够促使脑皮质神经细胞凋亡，并且激活GSK-3β活性，从而使脑部神经系统功能受损。

1 Dugue D,Malmierca MS.Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse：anesthesia and spontaneous activity effects〔J〕.Brain Struct Func，2015；220(6)：3358-98.

2 Forsyth RP，Hoffbrand BI.Redistribution of cardiac output after sodium pentobarbital anesthesia in the monkey〔J〕.Am J Physiol，1970；218(1)：214-7.

3 McGirr A，Berlim MT，Bond DJ，etal.A systematic review and meta-analysis of randomized，double-blind，placebo-controlled trials of ketamine in the rapid treatment of major depressive episodes〔J〕.Psychol Med，2015；45(4)：693-704.

4 Cao YL，Zhang W，Ai YQ，etal.Effect of propofol and ketamine anesthesia on cognitive function and immune function in young rats〔J〕.Asian Pac J Trop Med，2014；7(5)：407-11.

5 Brambrink AM，Evers AS，Avidan MS，etal.Ketamine-induced neuroapoptosis in the fetal and neonatal rhesus macaque brain〔J〕.Anesthesiolog，2012；116(2)：372-84.

6 Wang C，Liu F，Patterson TA，etal.Preclinical assessment of ketamine〔J〕.CNS Neurosc Ther，2013；19(6)：448-53.

7 张丽琴.脑脊液免疫球蛋白，乳酸脱氢酶及腺苷脱氨酶检测在成人颅内感染鉴别诊断中的临床意义〔J〕.中华医院感染学杂志，2012；22(8)：1752-4.

8 叶红伟，康品方，王洪巨，等.乙醛脱氢酶2在法舒地尔心肌保护作用中的机制〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(5)：1070-2.

9 Duman RS，Aghajanian GK.Neurobiology of rapid acting antidepressants：role of BDNF and GSK-3β〔J〕.Neuropsychopharmacology，2014；39(1)：233.

10 Nelson CD，Kim MJ，Hsin H，etal.Phosphorylation of threonine-19 of PSD-95 by GSK-3β is required for PSD-95 mobilization and long-term depression〔J〕.J Neurosci，2013；33(29)：12122-35.

11 倪 锦.氯胺酮对乳鼠脑皮质神经细胞凋亡的影响，机制探讨及参附注射液的防治〔D〕.广州：南方医科大学博士论文，2011.

12 Wei HJ,Xu JH,Li MH,etal.Hydrogen sulfide inhibits homocysteine-induced endoplasmic reticulum stress and neuronal apoptosis in rat hippocampus via upregulation of the BDNF-TrkB pathway〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2014；35(6)：707-15.

〔2015-11-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

肖 莉(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事麻醉方面研究。

R285

A

1005-9202(2016)21-5264-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.022