Gli表达下调对人胃腺癌AZ521细胞生长、转移的影响及机制
2016-12-05米源杜媛鲲刘庆熠廖海江王林王雷
米源,杜媛鲲,刘庆熠,廖海江,王林,王雷
(1河北医科大学第四医院,石家庄050011;2河北医科大学期刊社)
Gli表达下调对人胃腺癌AZ521细胞生长、转移的影响及机制
米源1,杜媛鲲2,刘庆熠1,廖海江1,王林1,王雷1
(1河北医科大学第四医院,石家庄050011;2河北医科大学期刊社)
目的 探讨锌指蛋白(Gli)表达下调对人胃腺癌AZ521细胞生长、转移的影响,并探讨其分子机制。方法 将培养好的人胃腺癌AZ521细胞随机分为实验组和空白对照组,分别用Gli1&Gli2 siRNA、对照siRNA进行转染。转染48 h收集细胞,用RT-PCR技术检测细胞内Gli1、Gli2 mRNA表达;Western blotting法检测细胞内Gli1、Gli2、细胞周期蛋白E(CyclinE)、p21、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果 转染48 h,与空白对照组比较,实验组Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表达下调,CyclinE、Vimentin和MMP-9蛋白表达下调,E-cadherin、p21蛋白表达上调,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,侵袭能力降低(P均<0.05)。结论 同时下调Gli1、Gli2基因表达可阻滞胃腺癌AZ521细胞周期、降低细胞侵袭能力,其机制可能与二者调节CyclinE、p21、E-cadherin、Vimentin和MMP-9的表达有关。
胃肿瘤;锌指蛋白基因;细胞周期;细胞侵袭
多数胃癌患者就诊时已处于进展期,即使经过常规治疗,但由于肿瘤细胞的高度侵袭性,复发转移仍是导致患者死亡的最主要原因。近年来研究表明,Hedgehog(Hh)信号通路的异常活化和下游目的基因的过度表达是多种高侵袭性恶性肿瘤的共同特征,其参与调控多种肿瘤的异常增殖、血管生成、侵袭转移及耐药[1~4]。既往关于Hh异常表达和胃癌侵袭转移的研究集中在对Hh上游通路Smo进行调控[5],而针对胃癌细胞中Hh通路的核心下游靶点锌指蛋白1(Gli1)和Gli2的调控与胃癌生物学行为关系的研究极少。2015年8月~2016年1月,本研究通过siRNA特异性抑制Gli在胃癌细胞中的表达,初步探讨Gli1、Gli2参与胃腺癌细胞生长、转移的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人胃腺癌细胞系AZ521(河北医科大学第四医院肿瘤研究所)。胎牛血清(美国Gemini公司),EMEM培养液(美国Gibco公司),SilencerTMSelect Gli1、Gli2和对照siRNA(美国Life Technologies公司),LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂(美国Invitrogen公司);总RNA提取试剂盒(德国 Qiagen公司);TaqManTM基因表达预混液(美国Applied Biosystems公司);TaqManTMGli1、Gli2及GAPDH的引物和探针(购自美国Life Technologies公司);Gli1兔抗人多克隆抗体、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)鼠抗人单克隆抗体、波形蛋白(Vimentin)兔抗人单克隆抗体和基质金属蛋白酶9(MMP-9)鼠抗人单克隆抗体(美国Abcam公司);细胞周期蛋白E(CyclinE)兔抗人单克隆抗体(美国Cell signaling公司);Gli2鼠抗人单克隆抗体、p21鼠抗人单克隆抗体和GAPDH鼠抗人单克隆抗体均(美国Santa Cruz公司)。Pierce-BCA蛋白分析试剂盒(美国Thermo Scientific公司);ECL 化学发光试剂盒(美国Thermo Scientific公司);ABI 7900HT高通量荧光定量RT-PCR仪(美国Applied Biosystems公司);Epics-XL 型流式细胞仪(美国 Beckman-Coulter公司);Matrigel 胶(美国BD公司);iScriptTMcDNA合成试剂盒(美国Bio-Rad公司);Transwell膜嵌套(美国Corning公司)。
1.2 细胞培养、分组及转染 将AZ521细胞培养于含10%胎牛血清的 EMEM培养基。将呈对数生长期的AZ521以3×105/孔接种于6孔板,细胞融合生长至50%~60%时更换无血清培养基。将细胞随机分为实验组和空白对照组。按照LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂说明书进行siRNA干扰引物的转染,将Gli1&Gli2 siRNA转染入实验组,对照siRNA转染入空白对照组,浓度均为100 nmol/L,于转染后6 h更换培养基。
1.3 细胞内Gli1、Gli2 mRNA表达检测 采用RT-PCR技术。转染后48 h收集细胞,按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组样本RNA并测定浓度。按照iScriptTMcDNA合成试剂盒说明书进行cDNA逆转录,条件:25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min。用无R-Nase水稀释cDNA,将反应体系10 μL(Taqman 基因表达预混液5 μL、cDNA 4.5 μL和TaqManTMGli1、Gli2、GAPDH各自的引物、探针0.5 μL)加样于384孔板,放置于ABI 7900HT高通量RT-PCR仪进行扩增,扩增条件:95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40 个循环。以GAPDH的Ct值作为内参,采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次,取平均值。
1.4 细胞内CyclinE、p21、E-cadherin、Vimentin及MMP-9蛋白表达检测 采用Western blotting法。转染后48 h收集细胞,PBS 洗涤3次,每个6孔板内加含有蛋白酶抑制剂的M-PER细胞总蛋白提取试剂100 μL,收集每组样本的总蛋白提取液,BCA法测定样本的总蛋白浓度。蛋白上样与SDS-PAGE凝胶电泳200 V 50 min。冰水浴转至PVDF膜100 V 1 h。室温5%脱脂奶粉的TBST液封膜1 h,分别加入一抗,4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10 min。分别加羊抗鼠或羊抗兔二抗(1∶20 000)室温孵育1 h,ECL试剂发光5 min后暗室曝光显影,Image软件检测蛋白条带灰度值。设定GAPDH为内参,蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。实验重复3次,取平均值。
1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。于转染后48 h制备单细胞悬液,PBS漂洗后置于4 ℃、70%冰乙醇固定30 min。用冷PBS漂洗3次,于37 ℃含碘化丙啶40 μg和RNaseA 100 μg的PBS中孵育30 min。上机检测各组样品的DNA含量,采用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析,计算每周期细胞百分比。实验重复3次,取平均值。
1.6 细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室实验。将Matrigel胶从-80 ℃冰箱中取出置于4 ℃待其融化,按1∶4比例用培养基稀释后铺于聚碳酸酯膜上并放置于培养箱待固化。24 h后收集细胞,吹打为单细胞悬液重悬在无血清培养液中,在Transwell小室上室加入包含7.5×104个细胞的细胞悬液100 μL,下室加含10%血清的培养液500 μL,于37 ℃、5% CO2中培养24 h,用棉棒擦去聚碳酸酯膜上层基质胶和未迁移的细胞,4%甲醇固定,0.1%结晶紫染色。倒置显微镜下高倍视野(×400)观察穿膜细胞数。每张膜随机观察4个视野取平均值。
2 结果
2.1 两组Gli1、Gli2 mRNA表达比较 转染后48 h,实验组Gli1、Gli2 mRNA相对表达量分别为0.31±0.03、0.37±0.04,空白对照组分别为1.00±0.02、1.00±0.05;实验组Gli1、Gli2 mRNA相对表达量低于空白对照组(P均<0.05)。
2.2 两组各类蛋白表达比较 转染后48 h,与空白对照组比较,实验组Gli1、Gli2、CyclinE、MMP-9和Vimentin蛋白相对表达量降低,p21、E-cadherin蛋白相对表达量升高(P均 <0.05)。见表1。
表1 两组各类蛋白表达比较
2.3 两组周期比较 转染后48 h,实验组G0/G1期细胞百分比(65.10±3.00)%,S期细胞百分比(32.99±2.50)%;空白对照组分别为(47.08±2.45)%、(50.85±2.70)%。与空白对照组比较,实验组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少(P均<0.05)。
2.4 两组侵袭能力比较 转染后24 h,实验组穿膜细胞数(179±7)个/视野,空白对照组为(260±11)个/视野,与空白对照组比较,实验组穿膜细胞数减少(P<0.05)。
3 讨论
Hh信号通路最初在1980年在研究果蝇幼虫体节发育的基因突变遗传分析时被发现并命名。经典的Hh信号通路自上而下主要由Hh配体、跨膜蛋白受体Ptch、Smo、核转录因子Gli和下游多种靶基因等构成,其通路的异常激活与肿瘤细胞的恶性生物学行为关系密切。因此,阐明Hh通路和肿瘤转移之间的关系将为临床肿瘤的治疗提供一个新思路。Yoo等[5]发现,Shh在胃癌组织中高表达,与临床分期和淋巴结转移等因素相关,应用Hh上游通路拮抗剂Cyclopamine可以抑制肿瘤细胞的转移和淋巴管生成。此外,有研究发现,核转录因子Gli作为Hh信号传导通路的核心调控枢纽,应用Gli抑制剂下调Gli表达比应用上游通路拮抗剂具有更高效的抑瘤作用,认为Gli可作为神奇的调控靶点[6]。本研究采用RNA干扰技术,应用siRNA下调人胃腺癌AZ521细胞的Gli1和Gli2表达,观察抗肿瘤效果并探讨Gli与胃癌细胞生物学行为的关系。结果显示,转染Gli1&Gli2 siRNA的胃癌AZ521细胞中内源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表达均显著下调,低于空白对照组,提示在胃癌AZ521细胞中存在Gli异常激活,应用特异性的Gli1、Gli2 siRNA能有效下调胃癌细胞中内源性Gli1、Gli2的表达。
细胞周期紊乱与肿瘤的发生密切相关,因此对细胞增殖的调节最终体现在细胞周期。本研究结果显示,实验组较空白对照组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,从而调控肿瘤细胞的异常增殖。CyclinE是参与细胞周期G1与S转换的重要正性调节因子,在肿瘤细胞G1晚期发挥正调控细胞周期的作用,促进肿瘤的异常增殖。研究发现,在前列腺癌细胞中应用Sox2可下调CyclinE进而抑制肿瘤的增殖[7]。p21作为周期蛋白依赖性激酶抑制剂可以与Cyclin-CDK复合物相结合调节细胞周期。p21表达上调可以通过抑制CDK2和CyclinE从而达到抑制上皮细胞增殖的作用[8]。目前关于胃腺癌细胞Gli表达与CyclinE、p21关系的研究国内外少有报道。本研究发现,沉默Gli1和Gli2基因表达后,胃腺癌AZ521细胞CyclinE蛋白表达下降,p21蛋白表达上调,表明Hh/Gli信号通路异常激活后诱导细胞恶性转化有可能是通过调节p21和CyclinE表达来完成,抑制Gli的表达可以调控AZ521的细胞周期。
肿瘤细胞除了异常增殖之外,另一个重要特征就是肿瘤细胞通过上皮-间质转化(EMT)的生物学过程失去了上皮细胞表型的紧密连接,同时获得间质细胞表型,促进细胞的侵袭、迁移。其中以上皮表型标志E-cadherin下调和间质表型Vimentin上调为重要特征,使肿瘤细胞更加富于侵袭性[9,10]。此外,MMP-9也是EMT的标记物之一,可以通过破坏、降解邻近肿瘤表面的细胞外基质和基底膜,促进肿瘤侵袭和转移。Moirangthem等[11]研究发现,下调MMP-9可以通过增加细胞间的黏附和调节EMT过程抑制乳腺癌的进展。Aaij等[12]发现,转染Vimentin基因的膀胱癌细胞中Vimentin和MMP-9蛋白表达上调,明显增强了膀胱癌细胞的侵袭性。本研究发现,下调Gli1、Gli2表达后可导致E-cadherin表达上调,Vimentin和MMP-9表达下调;Transwell小室实验进一步表明下调Gli1、Gli2表达后穿膜细胞数明显减少。究其原因可能是Gli通过下调E-cadherin和上调Vimentin表达,诱导EMT,促进胃癌细胞的侵袭转移,抑制Gli1和Gli2表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭。
综上所述,Gli siRNA能显著下调胃腺癌细胞中内源性Gli mRNA和蛋白的表达,Gli表达下调可以改变胃腺癌细胞周期分布和EMT进程,这可能与Gli调控Cyclin E、p2l、E-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表达密切相关。
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王雷(E-mail:yuankundu@163.com)
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