5-HTR2B、E-cad、α-SMA在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达变化*

涂容芳， 张秀峰， 何振华

(南华大学附属第二医院呼吸内科， 湖南 衡阳 421001)



5-HTR2B、E-cad、α-SMA在博莱霉素致大鼠肺纤维化中的表达变化*

涂容芳+， 张秀峰+， 何振华△

(南华大学附属第二医院呼吸内科， 湖南 衡阳 421001)

目的：观察5-羟色胺2B受体(5-HTR2B)、E-钙粘素(E-cad)、α-平滑肌蛋白(α-SMA) 在博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化中的表达变化。方法：健康雄性SD大鼠45只，随机分为3组(n=15)：对照组、BLM组、泼尼松+BLM组。各组分别于第7、14和28天各处死动物5只，取肺组织，行HE、Masson染色，观察大鼠肺组织炎症和纤维化的程度；免疫组化法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织中5-HTR2B、上皮细胞标记物E-cad和间质细胞标记物(α-SMA) mRNA及蛋白的表达水平。结果：BLM组肺组织病理切片HE和Masson染色按时间顺序呈现由肺泡炎症至纤维化的动态改变。免疫组化及RT-PCR结果显示肺纤维化大鼠肺组织中5-HTR2B、α-SMA的蛋白及mRNA表达均增加(P<0.05)，28 d时最高；E-cad蛋白及mRNA表达均减弱(P<0.05)，28 d时最低；泼尼松+BLM组，相应时间点5-HTR2B、α-SMA蛋白及mRNA表达有所下降(P<0.05)，E-cad蛋白及mRNA表达不同程度增强(P<0.05)。结论：5-HTR2B可促进大鼠肺纤维化发生，机制可能与减弱E-cad，促进α-SMA表达，诱导上皮细胞间质转化(EMT)有关。

5-HT2B受体；肺纤维化；上皮细胞间质转化；博莱霉素；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.020

特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种以反复肺泡上皮/内皮损伤，成纤维细胞(fibroblast,FB)异常增殖转型和细胞外基质 (extracellular matrix,ECM)大量沉积为主要表现特点的肺间质疾病[1]。其发病机制与不明原因的上皮/内皮细胞损伤后发生异常损伤修复有关[2]，且“成纤维细胞灶的形成”是损伤修复的主要标志[3]。关于成纤维细胞灶的形成目前有四种说法，其中EMT占肌成纤维细胞来源的30%以上，是目前研究的热点[4-6]。5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)亦称血清素，是一种新近发现的促纤维化生长因子，其生物学功能主要通过7种不同类型(5-HTlR-5-HT7R)受体及相应14种亚型受体实现，其中与肺组织关系最密切的为5-羟色胺2B受体(5-Hydroxytryptamine 2B receptor,5-HTR2B)。最新研究发现，5-HTR2B在肺纤维化肺泡上皮细胞特别是II型肺泡上皮细胞上存在高度表达[7]。因此，至于5-HTR2B是否可通过作用于肺泡上皮细胞诱导上皮细胞间质转化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)，促进肺纤维化发生值得我们进一步探究。糖皮质激素是目前国内临床抗肺纤维化使用的比较经典的药物之一[8]，常在肺纤维化作用机制探讨研究中被作为治疗组[9]。本研究以BLM气管内注射诱导大鼠肺纤维化，观察肺组织中5-HTR2B与上皮细胞标记物E-Cad和间质细胞标记物α-SMA的表达变化及关系，探讨5-HTR2B在肺纤维化中的作用及其对EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

注射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社生产，批号410102，每支15 mg)；醋酸泼尼松片(天津太平洋制药有限公司生产，每片5 mg，批号1109112)。兔抗Cadherin-Pan及α-SMA多克隆抗体购自ABZOOM公司。鼠抗5-HTR2B单克隆抗体购自BD公司。

1.2 动物分组及纤维化模型的建立

健康雄性SD大鼠45只，体重250～300 g，由南华大学动物实验部提供，随机数字表法分为对照组、BLM组、泼尼松+BLM组(n=15)。BLM组和泼尼松+BLM组各大鼠称重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5 ml/kg)，仰卧固定于鼠台上，颈部酒精消毒后逐层分离并暴露气管，注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，注入博莱霉素生理盐水溶液(5 mg/kg )，后立即将动物直立并左右旋转2 min，尽量使药液均匀分布于肺内，缝合皮肤待动物自然清醒后放置笼内常规饲养。造模当天开始，对照组、BLM组分别每天给予1%羧甲基纤维素钠(14 ml/kg)灌胃；泼尼松+BLM组每天灌予醋酸泼尼松甲基纤维素钠混悬液(0.56 mg/kg)。

1.3 标本的处理及取材

分别在造模第7、14、28天取材，每次各组随机处死5只大鼠。分离出气管和双肺，取左侧完整肺叶置于经DEPC水处理的4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，做HE、Masson染色及免疫组化，光镜下观察肺细胞损伤、胶原纤维增生及蛋白表达情况。取右肺切成小块保存于DEPC水处理过的EP管中， -80℃冰箱冻存，用于进行RT-PCR测定。

1.4 免疫组化检测及图像分析

取石蜡切片常规脱蜡至水，SP法染色，分别滴加1∶2 500 5-HTR2B Antibody抗鼠单克隆抗体、1∶1 000 兔抗平滑肌多克隆抗体、1∶500 Cadherin-Pan Antibody兔抗多克隆抗体，DAB显色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜检。阴性对照采用PBS替代一抗，其余步骤相同。将标本置于镜下40倍视野，在每张病理切片在染色阳性区随机选取6个视野，阳性表达为胞质内呈棕黄色颗粒，在400 倍视野下，采用Motic Image 3.2软件计算平均光密度值后进行统计学分析。

1.5 RT-PCR法检测肺组织中各指标mRNA的表达

取肺组织样品100 mg，将组织剪碎，加入1 ml Trizol，提取肺组织总RNA。采用第一条链合成试剂盒合成cDNA，检测大鼠肺组织5-HTR2B、E-cad、α-SMA、β-actin 1、β-actin 2的引物均由上海生工生物技术有限公司设计和合成，5-HTR2B序列F1：AGGCTACATGGCCCCTCCCACT及R1：TAGGGACTGGGATGGCGATG，扩增产物长度为222 bp；E-cad序列 F1：AGCCAGACACATTCATGGAAC 及 R1：TGGTTATCCGAGAGCTTGAGA扩增产物长度为351 bp；α-SMA 序列 F1： TTCCTTCGTGACTACTGCTGAG及R1：CAATGAAAGATGGCTGGAAGAG 扩增长度为209 bp；β-actin 1序列F1: TCAGGTCATCACTATCGGCAAT 及R1: AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA扩增长度为432 bp；β-actin 2 序列 F1: CCCATCTATGAGGGTTACGC及R1: TTTAATGTCACGCACGATTTC扩增长度为150 bp。按试剂盒说明书取2×PCR Master-mix 12.5 μl，cDNA 2 μl, 10 μmmol/L的上游、下游引物各1 μl加无酶水配成25 μl PCR反应体系，离心混匀(表1)。

取PCR产物和内参PCR产物按要求加入配制好的含溴化己锭的1.5%琼脂糖凝胶上，电泳后紫外灯下进行拍照，在凝胶图像分析系统中计算各组产物的灰度值，目的产物mRNA表达量的半定量结果用两者的比值表示。

Tab. 1 PCR amplification reaction conditions of genes

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 HE和Masson染色光学显微镜观察

对照组大鼠肺组织结构正常，HE染色未见炎性细胞渗出，Masson染色仅见细支气管壁周围及肺泡间隔有少量胶原纤维沉着。BLM组7 d肺组织结构被破坏，肺泡腔出现萎陷变窄，肺泡间隔出现增宽，有少许炎症细胞浸润、成纤维细胞增生及蓝绿色胶原纤维沉积；14 d肺组织结构破坏加重，更多肺泡腔出现萎陷变窄，肺泡间隔进一步增宽，可见较多炎症细胞浸润、成纤维细胞增生及蓝绿色胶原纤维沉积；28 d肺组织结构破坏明显，肺泡腔塌陷融合或消失，肺泡间隔明显增宽，肺泡炎症改变有所减轻，但可见大量成纤维细胞增生及蓝绿色胶原纤维增生沉积。与BLM组对应时间点相比，泼尼松+BLM组大鼠肺组织在肺泡腔塌陷，肺泡间隔增宽，炎症细胞浸润，肺泡结构破坏及胶原纤维沉积等各方面均有不同程度减轻(图1、图2，图1-2见彩图页Ⅸ)。

2.2 肺组织5-HTR2B蛋白及mRNA的表达

5-HTR2B主要分布于肺泡上皮细胞。与对照组比较，BLM组大鼠肺组织5-HTR2B蛋白和mRNA在7 d、14 d、28 d时均存在表达增强，以28 d时最明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。泼尼松+BLM组大鼠肺组织5-HTR2B蛋白和mRNA水平在7 d、14 d、28 d时均较BLM组均有不同程度降低(P<0.05)；但较对照组均有不同程度升高(P<0.05)(图3，表2，图3见彩图页Ⅸ)。

2.3 肺组织E-cad蛋白及mRNA的表达

E-cad表达的范围与5-HTR2B基本相似，主要分布于肺泡上皮细胞。与对照组相比，BLM 7 d、14 d、28 d时的E-cad蛋白和mRNA含量均存在降低，28 d时达最低，差异有统学意义(P<0.05)；与BLM组对应时间点比较，泼尼松+BLM组7 d、14 d、28 d的E-cad蛋白和mRNA含量较BLM组对应时间点存在不同程度升高(P<0.05)；但与对照组比较有降低(P<0.05，图4，表3，图4见彩图页Ⅸ)

2.4 肺组织α-SMA蛋白及mRNA的表达

α-SMA主要存在肺间质基质及成纤维细胞中。与对照组比较，BLM组7 d、14 d、28 d时的α-SMA蛋白和mRNA含量均升高，28 d时达最高，差异均有统学意义(P<0.05)；泼尼松+BLM组各时间点的α-SMA蛋白和mRNA含量较BLM组均存在不同程度降低(P<0.05)；但与对照组相比均显著升高(P<0.05，图5，表4，图5见彩图页Ⅹ)。

Tab.

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; 5-HTR2B: 5-Hydroxytryptamine 2B receptor

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

Tab. 3 Protein and mRNA expression of E-cad in lung tissue of ±s)

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; E-cad: E-cadherin

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

Tab. 4 The protein and mRNA expression of α-SMA in lung tissue of ±s)

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; α-SMA： Alpha-smooth muscle actin

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

3 讨论

目前关于IPF的治疗研究已由传统“抗炎”转向“抗纤维化”[10]。近年来研究发现：5-HT是一种致纤维化生长因子，可促进呼吸系统中肺动脉血管、支气管收缩，刺激多种细胞等生长，诱导肺血管和/或呼吸道发生组织重建，导致肺纤维化形成[11]。继Eickelberg工作组报道发现5-HTR2B在IPF及非特异性间质性肺炎患者中表达增强后，Melanie[12]等运用RT-PCR技术发现肺纤维化实验模型和肺纤维化患者5-HT2RB mRNA水平均显著升高，Svejda[13]等在体外细胞培养实验中也发现5-HTR2B拮抗剂特麦角脲(terguride)或SB 204741可有效降低TGF-β诱导纤维母细胞产生的胶原蛋白水平。因此G蛋白偶联受体5-HTR2B被认为是抗纤维化治疗潜在靶点。本实验首次利用免疫组化和RT-PCR方法检测大鼠肺组织5-HTR2B蛋白及mRNA的表达。结果发现5-HTR2B在肺泡上皮细胞中存在表达。根据中华医学会呼吸病学分会特发性肺间质纤维化诊断和治疗指南，糖皮质激素是抗纤维化治疗中推荐药物[14]，其中醋酸泼尼松片在临床抗肺纤维化中常被使用。本实验以泼尼松+BLM为治疗组，发现泼尼松治疗后各组5-HTR2B蛋白及mRNA水平存在不同程度的下降。由此进一步证实，5-HTR2B与肺纤维化发生密切相关，是促纤维化发生的重要因子。

5-HTR2B可调节血管缩舒、促进炎症发生、参与组织修复，是近年来被提出的抗纤维化治疗靶点[15]。其发生机制可能与增强纤维化微环境中TGF-β、CTGF、纤溶酶原激活物抑制剂-1等细胞因子表达，促进成纤维细胞、上皮或内皮等多种来源肌成纤维细胞增殖、转型、收缩，分泌大量细胞外基质蛋白有关[16]。Clara等[17]实验发现5-HT与5-HTR2B结合后可通过激活TGF-β/Smad信号促进表皮纤维母细胞分泌大量细胞外基质蛋白。Konigshoff等[18]检查发现肺纤维化患者肺组织中存在5-HTR2B的高度表达，体外细胞实验发现使用相应拮抗剂后，TGF-β表达水平显著下降，进一步证明5-HT/5-HTR2B /TGF-β轴的存在。

TGF-β是目前公认的最主要致纤维化细胞因子，除作用于成纤维细胞外，还是诱导EMT过程的关键因素。EMT是指已完全分化的上皮细胞经历细胞表型改变转化成完全分化的间质细胞(通常指成纤维细胞和肌纤维母细胞)的过程。Ruiz[19]等研究发现5-HTR2B在纤维化肺组织肺泡上皮细胞中存在高度表达。有学者进一步研究发现5-HT与5-HTR2B结合后通过Ras/MAPK(丝裂素活化蛋白激酶)途径促进细胞有丝分裂的同时可启动下游TGF-β分子促进纤维化发生，而Ras和TGF-β分子已在实验中被证实是EMT过程发生不可或缺的分子。于是我们大胆推测5-HTR2B受体可能为TGF-β介导的EMT的上游分子，即受损肺组织微血管中过量产生的5-HT可通过与上皮细胞上相应的5-HTR2B结合，在TGF-β作用下诱导上皮细胞丧失原有细胞表型(如上皮特异性的表型标记物E-cad)转变为拥有间质特征(如α-SMA)的肌成纤维细胞，与此同时获得迁移、侵袭能力，在受损肺泡基底膜处聚集，形成“成纤维细胞灶”促进细胞外基质过量分泌和肺纤维化的发生。本实验研究结果显示：BLM致大鼠肺纤维化模型中，5-HTR2B和E-cad表达的范围基本相似，主要分布于肺泡上皮细胞。E-cad的表达量和5-HTR2B表达量相反，E-cad在正常肺组织中表达较多，在BLM致大鼠肺纤维化模型中随纤维化程度加重而表达逐渐减少；而5-HTR2B和α-SMA都随着肺纤维化程度增加而逐渐增加。但两者表达的区域不完全相同，5-HTR2B 主要存在肺泡上皮细胞中，而α-SMA主要存在肺间质基质及成纤维细胞中；且使用激素干预后可出现相反的结果。通过以上结果我们推测5-HTR2B促纤维化机制可能与减低E-cad的表达，促进α- SMA的表达，诱导EMT发生有关。故5-HTR2B可参与BLM致肺纤维化发生，机制之一可能与诱导 EMT 发生有关。

肺纤维化预后差，病死率高，严重危害人类健康，目前除了肺移植，尚无有效治疗措施。深究5-HT/5-HTR2B信号通路，不仅可进一步阐述肺纤维化发生机制，还可为新型抗纤维化药物的研发提供新的思路和理论依据。

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The expression of 5-HTR2B、E-cad、α-SMA in the pulmonary fibrosis in rats

TU Rong-fang+, ZHANG Xiu-feng+, HE Zhen-hua△

(Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001， China)

Objective: To observe the expression of 5-Hydroxytryptamine 2B receptor (5-HTR2B)、E-cadherin (E-cad)、alpha-smooth muscle actin(α-SMA) in the bleomycin -induced pulmonary fibrosis tissue of rats. Methods: Forty-five healthy male SD rats were randomly divided into control group，bleomycin group and bleomycin +prednisone group(n=15)． Five rats in each group randomly sacrificed at the 7th、the 14thand the 28thday after eastablishing models． The lung tissue was observed by microscope in HE and Masson staining． Lung hydroxyproline (HYP) content was evaluated． The expression of protein and mRNA of 5-HTR2B, E-cad and α-SMA were analyzed by immunohistochemistry and/or RT-PCR． Results: A dynamic changes from alveolitis to pulmonary fibrosis could be observed in the slices by HE and Masson staining. The experimental results by immunohistochemistry and RT-PCR showed that the protein and mRNA expression of 5-HTR2B and a-SMA enhanced rat pulmonary fibrosis (P<0.05)and reached the highest at the 28thday； the corresponding protein and mRNA expression of E-cad reduced (P<0.05)， and reduced to the lowest value at the 28thday． Compared with bleomycin group， the corresponding mRNA and protein expression of 5-HTR2B and a-SMA in bleomycin+prednisone group had decreased (P<0.05)； however， the corresponding mRNA and protein expression of E-cad had increased(P<0.05)． Conclusion: 5-HTR2B is involved in the pathogenesis of pulmonary fibrosis throught epithelial- mesenchymal transition (EMT)．

5-HTR2B； pulmonary fibrosis； epithelial-mesenchymal transition； bleomycin; rat

2015-06-04

2016-03-04

+： 共同第一作者

R73-3

A

1000-6834(2016)04-365-07

△【通讯作者】Tel： 13974755267； E-mail： 1425271618@qq.com.