连翘药材的高效液相色谱特征图谱研究Δ

李月婷，任 易，彭治添，晁凌会，张 媛，李 军

(1.北京中医药大学中药现代研究中心，北京100029； 2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)



·本期特稿·

连翘药材的高效液相色谱特征图谱研究Δ

李月婷1，2*，任 易1，2，彭治添1，2，晁凌会1，2，张 媛2，李 军1#

(1.北京中医药大学中药现代研究中心，北京100029； 2.北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的：建立连翘药材的特征图谱分析方法。方法：采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长230 nm，柱温25 ℃，建立不同产地连翘的高效液相色谱特征图谱；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行相似度评价。结果：通过对14批次不同产地连翘样品的分析，建立了连翘药材的特征图谱，确定了6个共有特征峰，并指认了其中5个特征峰的结构，分别为芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、槲皮素和牛蒡子苷元。结论：本研究建立的连翘药材特征图谱的特征性和专属性强，且方法简便、可靠，重复性好，为更好地控制连翘药材的内在质量提供了科学依据。

连翘； 特征图谱； 高效液相色谱； 质量控制

连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，于秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；于果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛[1]。化学成分和药理研究结果表明，连翘中主要含有三萜类、苯乙醇苷类、木脂素类、挥发油类等物质[2-4]，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及解热镇痛等活性[2]。连翘良好的清热解毒功效推动了以连翘为主药的中成药制剂的研发逐年增加，如银翘解毒片、双黄连口服液、注射用双黄连(粉针剂)、抗病毒口服液等。现行《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)以连翘苷和连翘酯苷A的含量测定来控制连翘药材的质量，但在医药市场上，由于连翘同属植物秦连翘、金钟花、丽江连翘、奇异连翘、卵形连翘等也具有相同成分而被混作连翘使用[5-7]。因此，测定2个指标成分的含量在一定程度上难以全面反映药材的真伪与质量的优劣。中药特征图谱是选取中药指纹图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的重要鉴别手段，它是近年来中药质量控制的一个研究热点[8-9]。本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立连翘药材的特征图谱，以对照药材为随行对照，用于鉴别连翘药材的真伪，旨在为该药材的鉴别及质量评价提供方法和依据。

1 材料

1.1 仪器

岛津分析型HPLC色谱仪(包括二极管阵列检测器、二元高压梯度泵、真空脱气机、柱温箱、自动进样器；Labsolution 色谱工作站)(日本岛津公司)；超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司)；METTLER XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

14批连翘药材(药材来源见表1)经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。连翘对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120908-201216)；连翘苷、连翘酯苷A、槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110821-201213、111810-201405、100081-201408)；牛蒡子苷元、芦丁对照品(上海诗丹德生物技术有限公司，批号：STA-88700000、STA-39507019)；甲醇(北京化工厂，分析纯)；甲酸(天津市永大化学试剂有限公司，分析纯)；甲醇、乙腈(fisher公司，色谱纯)；水为Milli-Q超纯水。

表1 14批次连翘样品的来源和相似度

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～35 min，12%～20% A；35～45 min，20%～27% A；45～55 min，27%～35% A；55～70 min，35%～54% A)；柱温25 ℃；进样量10 μl；流速1.0 ml/min；检测波长230 nm。理论板数按连翘酯苷A计算应不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、槲皮素和牛蒡子苷元对照品适量，加70%甲醇配成每1 ml含芦丁100 μg、连翘酯苷A 1 mg、连翘苷100 μg、槲皮素100 μg和牛蒡子苷元100 μg的混合溶液作为对照品参照物溶液，备用；取连翘对照药材约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，密塞，称定质量，浸泡20 min，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，放至室温(25 ℃)，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取连翘粉末(过五号筛)约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，密塞，称定质量，浸泡20 min，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，放至室温(25 ℃)，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，滤过，取续滤液，即得。

2.4 精密度试验

取连翘药材粉末(S6)约1 g，按“2.3”项下的方法制备，在相同色谱条件下连续进样6次，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰2(连翘酯苷A)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。结果显示，连续进样6次所得的色谱图相似度均>0.99，RSD<2%，经计算，各色谱峰与峰2的相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明该方法的精密度符合分析方法的要求。

2.5 重复性试验

取连翘粉末(S6)约1 g，按“2.3”项下的方法平行操作6次，制备6份供试品溶液，将所得供试品溶液分别进样，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰2(连翘酯苷A)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。结果显示，各色谱图的相似度均>0.98，RSD<2%，经计算，各色谱峰与峰2的相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明该方法的重复性好。

2.6 稳定性试验

取连翘粉末(S6)约1 g，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μl，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较。以色谱峰2(连翘酯苷A)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间。各色谱图的相似度均>0.96，RSD<2%，经计算，各色谱峰与峰2的相对保留时间均在规定值的±5%之内，且相对保留时间的RSD<2%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 特征图谱的建立

取14批次连翘样品，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，进样进行分析。将所得各色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行数据处理。以S6为参照图谱，时间窗为0.1 min，中位数法，经多点校正自动匹配生成连翘药材对照特征图谱，见图1。通过对14批次连翘样品特征图谱分析，发现图中1—6号峰为所有样品溶液色谱图中共有色谱峰，且峰面积相对较大。因此，确定此6个色谱峰为连翘特征图谱的共有特征峰。以色谱峰2(连翘酯苷A)为参照峰，计算其他5个色谱峰的相对保留时间，结果见表2。在相同的色谱条件下，将连翘对照药材按“2.3”项下的方法制备为对照药材溶液，进样分析，所得结果见图2(B)。将标准品溶液进样分析，并与样品特征图谱中相应色谱峰进行比较，确定样品特征图谱中的峰1、2、4、5、6分别为芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、槲皮素和牛蒡子苷元，见图2(C)。

图1 14批次连翘药材样品HPLC特征图谱与对照特征图谱叠加图Fig 1 Overlapped HPLC characteristic fingerprints of 14 batches of Forsythiae Fructus and reference chromatogram

样品编号1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰S1093771000011514162021791621316S2093961000011535162661798721405S3093861000011519162181792821332S4094281000011515162571798121402S5094221000011519162791800621439S6094191000011515162451796721396S7094191000011522158261797221390S8094431000011543162911801321443S9094411000011552163071803721477S10094341000011538162711799821418S11094311000011538162591798021396S12094291000011536162461796321373S13094281000011522162191792621334S14094121000011525162301794621351平均值094191000011528162231797321391RSD/%0210011073020022

A.样品；B.对照药材；C.混合对照品；1.芦丁；2.连翘酯苷A；4.连翘苷；5.槲皮素；6.牛蒡子苷元A.Samples; B.Reference herb; C.mixed standards；1.Rutin; 2.Forsythoside A; 4.Phillyrin; 5. Quercetin; 6.Arctigenin图2 连翘药材、对照药材和对照品的HPLC图Fig 2 HPLC chromatagrams of Forsythiae Fructus samples, reference herb and mixed standards

2.8 特征图谱相似度评价

将14批次样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)进行数据处理，得到对照图谱，继而得到样品与对照图谱的匹配图，见图1。计算14批次供试品色谱图和对照图谱之间的相似度数据，结果见表1，14批次样品相似度均>0.90，说明本实验收集的14批次连翘药材质量均较好，一定程度上反应了市场上流通的连翘药材质量较好。

3 讨论

在14批次样品中，S6连翘药材样品的色谱峰最多，因此用S6样品进行色谱条件、提取方法及方法学的考察；由相似度软件得到的14批连翘的色谱图中共有峰较多，但由于有的色谱峰对应的成分在某些批次的药材中含量较小或检测不到，故选择出峰时间基本一致、峰面积较大的6个峰为共有特征色谱峰。

实验过程中考察了不同色谱条件，包括色谱柱、检测波长、流动相、洗脱梯度、进样量、柱温、流速对分析方法建立的影响。最后确定的色谱条件为：Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-水梯度洗脱；柱温25 ℃；进样量10 μl；流速1.0 ml/min；检测波长230 nm。

在提取方法的选择上，分别用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇作为提取溶剂，15、30、60和90 min作为提取时间，超声(30 min)、加热回流(30 min)和浸泡提取(24 h)作为提取方式，20、30和40 ml作为提取体积，考察不同提取条件所获得的图谱。结果表明，70%甲醇30 ml超声提取30 min的提取效率高且方法简便。实验中发现，超声提取前浸泡20 min，实验重复性好，有利于更充分地提取样品。

本实验通过对市场上采集的14批次连翘药材的图谱分析，建立了连翘药材的特征图谱，14批次不同产地的连翘药材特征图谱相似度较高，均>0.90，说明不同产地连翘药材的化学成分较一致，但应注意色谱峰对应的成分在含量上有一定的差异。通过对14批次样品特征图谱中色谱峰的分析，确定了6个共有特征峰；通过与混合对照品溶液对照，鉴定其中5个共有特征峰的结构分别为芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、槲皮素和牛蒡子苷元。其中，2号峰的峰面积较大，且分离度与对称性均良好，因此将2号峰作为参照峰S，计算各批次样品中共有特征峰的相对保留时间。结果峰1、3、4、5、6的相对保留时间分别为0.942、1.153、1.622、1.797、2.139。在相同的色谱条件下，连翘对照药材的色谱图中也呈现与对照特征图谱中共有特征峰相应的6个色谱峰。在连翘药材的鉴别检测中，通过对照药材随行对照，采用特征图谱能够实现对连翘药材的真假鉴别。因此，在药材的质量评价过程中，应将特征图谱与《中华人民共和国药典》的检测项目结合起来，真正做到控制连翘药材及其相关制剂的质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 [S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：159.

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Study on the Characteristic Fingerprint of Forsythiae Fructus by HPLCΔ

LI Yueting1,2, REN Yi1,2, PENG Zhitian1,2, CHAO Linghui1,2, ZHANG Yuan2, LI Jun1

(1.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2.School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

OBJECTIVE：To establish the HPLC characteristic fingerprint for the quality control of Forsythiae Fructus. METHODS: Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) was adopted, the mobile phase was composed of acetonitrile(A) and water(B) with a gradient elution solvent system with flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 230 nm and the column temperature was 25 ℃. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (version 2004A) was used to calculate the similarity of the HPLC characteristic fingerprint of Forsythiae Frucuts from different habitats. RESULTS: HPLC characteristic fingerprint was established with six common characteristic peaks based on the analysis of 14 batches of Forsythiae Frucuts Five common characteristic peaks were identified as rutin, forsythoside A, forsythin, quercetin, and arctigenin. CONCLUSIONS: The established method shows good characteristics, specificity, and repeatability, which can provide a scientific basis for the identification and quality control of Forsythiae Frucuts.

Forsythiae Fructus; Characteristic fingerprint; HPLC; Quality control

国家工信部中药材扶持项目；教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目(No.NCET-13-0693)

R931

A

1672-2124(2016)10-1297-03

2016-08-26)

*硕士研究生。研究方向：中药药效物质基础和质量评价。E-mail：yuetingli1111@163.com

#通信作者：副研究员，硕士生导师。研究方向：中药药效物质、作用机制和质量评价。 E-mail：drlj666@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.001