超声皂化法提取β-隐黄素

黄巧娟，盛冉，孙志高，郝静梅

(西南大学 柑桔研究所，重庆 400712)



超声皂化法提取β-隐黄素

黄巧娟，盛冉，孙志高*，郝静梅

(西南大学 柑桔研究所，重庆 400712)

以砂糖橘皮粉为原料，采用超声皂化法提取精制β-隐黄素。对比考察了水浴皂化与超声皂化对β-隐黄素得率的影响；考察超声皂化温度、皂化时间、KOH浓度、KOH-乙醇添加量、正己烷添加量等因素对超声皂化反应的影响，对超声皂化反应进行单因素及正交试验, 确定超声皂化的最适工艺条件。结果表明:超声皂化与水浴皂化相比能缩短皂化时间，提高β-隐黄素得率；超声皂化最佳工艺条件为,超声时间1 h、超声温度30 ℃、KOH浓度为1.5 mol/L，正己烷添加量为4 mL，β-隐黄素得率为0.238 4‰。

水浴皂化；超声皂化；β-隐黄素得率；工艺优化

β-隐黄素又称β-隐黄质，3-羟基-β-胡萝卜素，是人体血液中存在的六大类胡萝卜素之一，主要存在于水果、蔬菜中，其分子式为C40H56O，分子质量为552.88，分子结构如图1所示[1]。近年来大量流行病学的调查与研究表明，β-隐黄素具有抗氧化、抗癌、缓解骨质疏松、预防心血管疾病等多种生理功能[1-2]。β-隐黄素作为功能性成分，越来越受到研究者的重视。近期的研究表明，β-隐黄素可能成为比β-胡萝卜素更好的VA前体物质[3]。

图1 β-隐黄素的分子结构Fig.1 The molecular structure of β-cryptoxanthin

β-隐黄素酯的形式存在于水果及蔬菜中，如β-隐黄素月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯等[4-5]。通过皂化反应将β-隐黄素酯转化为游离的β-隐黄素，是分离纯化β-隐黄素，提高最终产品中β-隐黄素含量的重要手段。皂化通常有冷皂化及热皂化两种，热皂化速度快，但对活性物质损失较大；冷皂化耗时较长，皂化时间越长对生物活性物质影响越大[6]。超声波提取具有提取时间短、提取率高等优点，其作为一种辅助手段已运用于叶黄素酯、番茄红素酯等物质的皂化[7-8]。本试验以砂糖橘皮粉为原料，通过乙醇提取获得总酯萃取物，运用皂化法制备β-隐黄素单体，通过皂化破坏总酯萃取物中的脂肪、叶绿素等物质，使β-隐黄素单体从β-隐黄素酯中游离出来，从而达到提取精制β-隐黄素的目的。本文对比分析了水浴皂化及超声皂化对β-隐黄素得率的影响，并对超声皂化工艺条件进行研究，以获得最优的皂化工艺条件，减少皂化过程中β-隐黄素的降解损失。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干燥的砂糖橘皮粉、正己烷(AR)、KOH(AR)、无水乙醇(AR)、丙酮(AR)、β-隐黄素标准品(Sigma公司)、乙腈(HPLC)、乙酸乙酯(HPLC)、NaCl(AR)。

1.2 仪器与设备

BT224S电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；H-1850R高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司)，KQ5200E型超声波仪器，昆山市超声波仪器有限公司；UltiMate3000高效液相色谱仪，戴安中国有限公司；双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；恒温水浴锅，上海双舜实业发展有限公司；TTL-DCI型氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；6202型高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；真空泵，南京真空泵厂。

1.3 实验方法

1.3.1 β-隐黄素标品的制备

参考蒋国玲的方法[9]，并稍作修改。将1 mg β-隐黄素标准品用丙酮溶解并定容至10 mL，分别取100、200、300、400、500、600、900 μL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容至10 mL，摇匀。以丙酮做参比，在451 nm处测定吸光度A。对吸光值做线性回归方程，得到吸光度(A)-浓度(C)的标准曲线。

1.3.2 高效液相色谱条件[10]

PDA检测器、C18柱、流动相：A为乙酸乙酯，B为体积分数90%的乙腈，A∶B体积比为 40∶60、检测波长：451 nm、柱温：30℃、流速：1 mL/min、进样量：20 μL。

1.3.3 β-隐黄素得率的计算[11]

(1)

式中：C为β-隐黄素的浓度；V为β-隐黄素样品总体积；m为砂糖橘皮粉样品干重。

1.3.4 超声皂化法与水浴皂化法的对比

称取400g经40 ℃干燥的砂糖橘皮粉，用1 200mL无水乙醇在40 ℃条件下水浴浸提4h，重复提取两次。将提取液真空浓缩至不再有溶剂旋出，得总酯萃取物50mL。取5mL总酯萃取物于50mL烧杯中，分别加入5mL正己烷、KOH-乙醇溶液(2mol/L)，密封。分别于0.08、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5h取1mL样品于分液漏斗中，加入2mL正己烷萃取2次，收集上相。用4mL0.5%的NaCl水溶液水洗3次，收集有机层，在451nm波长下进行含量测定。

1.3.5 单因素试验

通过单因素试验对β-隐黄素皂化反应中影响β-隐黄素得率的各因素进行分析，确定最佳工艺参数。

1.3.5.1 皂化时间

取6份1mL的总酯萃取物，分别置于25mL的具塞试管中，并分别加入正己烷1mL及2mol/L的KOH-乙醇溶液1mL后震荡摇匀。设置超声波温度为40 ℃，研究皂化时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h时对β-隐黄素得率的影响。

1.3.5.2 皂化温度

取5份1mL的总酯萃取物，分别置于25mL的具塞试管中，并分别加入正己烷1mL及2mol/L的KOH-乙醇溶液1mL后震荡摇匀。皂化时间为1.0h，研究皂化温度分别为30、40、50、60、70 ℃时β-隐黄素的得率。

1.3.5.3KOH浓度的影响

取8份1mL的总酯萃取物，分别置于25mL的具塞试管中，并分别加入正己烷1mL及不同浓度的KOH-乙醇溶液1mL于试管中后，震荡摇匀。固定超声温度为40 ℃、皂化时间为1.0h，研究KOH浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mol/L时对β-隐黄素得率的影响。

1.3.5.4KOH-乙醇溶液添加量的影响

取8份1mL的总酯萃取物，分别置于25mL的具塞试管中，并分别加入正己烷1mL于试管中，固定超声温度为40 ℃、皂化时间为1.0h，KOH浓度为1.5mol/L，研究KOH-乙醇溶液的添加量分别为0.5、1、2、4、6、8、10mL时对β-隐黄素得率的影响。

1.3.5.5 正己烷添加量的影响

取7份1mL的总酯萃取物，分别置于25mL的具塞试管中，并分别加入1.5mol/L的KOH-乙醇溶液6mL。固定超声温度为40 ℃，超声时间为1.0h，研究正己烷添加量分别为0、1、2、3、4、5、6mL时对β-隐黄素得率的影响。

1.3.6 正交试验优化超声皂化β-隐黄素工艺参数

通过单因素试验，选择超声时间、超声温度、KOH浓度、正己烷添加量4个因素作为优化的单因素，以β-隐黄素得率为评价指标，进行4因素3水平正交试验设计，优化β-隐黄素的皂化工艺。用SPSS17.0软件对实验数据进行回归分析，确定最佳工艺参数。

表1 正交试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

实验得到的β-隐黄素标准曲线(图2)回归方程为A=0.104 17C-0.006 03，其中R2=0.998 5由此可知β-隐黄素在1～9 μg/mL内有良好的线性关系，可做为β-隐黄素含量测定的标准曲线。

图2 β-隐黄素标准曲线Fig.2 Standard curve of β-cryptoxanthin

2.2 皂化前后样品的HPLC图

图3为β-隐黄素标准品的高效液相色谱图，出峰时间为13.6 min左右。图4为β-隐黄素样品在皂化前后的HPLC图，从图4中可以看出，皂化前的样品，13.6 min峰面积较小，主要物质出峰时间为14 min之后。这可能是因为未皂化的β-隐黄素主要以β-隐黄素酯的形式存在，而β-隐黄素酯的出峰时间为14 min之后，这一结果与Dietmar等的研究一致[12]。图5为皂化后的β-隐黄素酯，从图中可以看出，β-隐黄素出峰时间为13.61 min，且在15 min之后几乎没有出现峰，说明皂化反应能有效的将β-隐黄素从其酯形式中释放出来。

图3 β-隐黄素标准品高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of β- cryptoxanthin standard

图4 样品皂化前的HPLC图Fig.4 HPLC diagram of the sample before saponification

图5 样品皂化后的HPLC图Fig.5 HPLC diagram of the sample after saponification

2.3 超声皂化法与水浴皂化法的对比

由图6可知，超声皂化反应相比水浴皂化反应，所需时间更短，且皂化效果更好。超声皂化反应随着皂化时间的延长，β-隐黄素得率增加迅速，在皂化时间为1.0 h时，皂化反应达到最大值，此时得率0.014 9%。水浴皂化整体得率相比超声皂化较低，在皂化3.5 h后β-隐黄素得率达到最大值，为0.013 1%。因此，从试验结果可以看出，超声皂化相比水浴皂化能节约更多的时间，且皂化效果更好。在皂化一段时间后，2种皂化方式都使β-隐黄素得率有细微降低，这可能与β-隐黄素不稳定，易降解有关。

图6 不同皂化方式对β-隐黄素得率的影响Fig.6 Effect of different methods on the yield of β-cryptoxanthin

2.4 单因素试验结果

2.4.1 超声时间单因素

由图7可知，当超声时间为0.5 h后，β-隐黄素得率迅速上升，当超声时间为1.0 h时，β-隐黄素得率达到最大，在超声时间继续延长时，β-隐黄素得率有所下降。故选择超声时间为1 h较为适宜。

图7 超声时间对β-隐黄素得率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic time on the yield of β-cryptoxanthin

2.4.2 KOH浓度的选择

由图8可以看出，KOH浓度对β-隐黄素得率有一定的影响。当KOH浓度低于2 mol/L时，对β-隐黄素得率影响较大。随着KOH浓度的升高，β-隐黄素得率提高，当KOH浓度达到1.5 mol/L时，β-隐黄素得率最大，达到0.017 6%，故选择KOH浓度为1.5 mol/L较为适宜。

图8 KOH浓度对β-隐黄素得率的影响Fig.8 Effect of the concentration of KOH on the yield of β-cryptoxanthin

2.4.3 超声温度的选择

如图9所示，随着超声温度的升高，β-隐黄素得率有缓慢升高的过程，当温度升高到40 ℃后，β-隐黄素得率达到最大值。但当温度继续升高时，β-隐黄素的得率下降显著，这主要与高温会破坏β-隐黄素的结构有关。故选择最适超声温度为40 ℃。

图9 超声温度对β-隐黄素得率的影响Fig.9 Effect of ultrasonic temperature on the yield of β-cryptoxanthin

2.4.4 KOH-乙醇溶液添加量的影响

由图10可知，当KOH-乙醇溶液的体积6 mL时，β-隐黄素得率最高。当KOH-乙醇体积继续升高时，β-隐黄素得率有所下降，这可能与皂化时加入的正己烷有关。不同比例的正己烷-乙醇-水形成不同的分配体系，影响β-隐黄素在萃取上相及下相的分布[8,13]。因此，加入不同体积的KOH-乙醇溶液β-隐黄素得率略有差异。

图10 KOH-乙醇添加量对β-隐黄素得率的影响Fig.10 Effect of KOH- ethanol addition on the yield of β-cryptoxanthin

2.4.5 正己烷添加量的影响

从图11可以看出，正己烷的添加量对β-隐黄素的得率有较大影响。皂化时随着正己烷添加量的增加其β-隐黄素得率也逐渐增高。当正己烷添加量为3 mL时，β-隐黄素得率达到最大值，为0.018 12%；但若继续增加正己烷的量则β-隐黄素的得率反而有所下降。造成此现象的原因主要有两个，正己烷-乙醇-水形成液液萃取体系，改变了β-隐黄素在乙醇相及正己烷相的分布；正己烷的添加使得体系中KOH的浓度发生改变，从而造成皂化效果不一致。本实验选用正己烷适宜添加量为3 mL。

图11 正己烷添加量对β-隐黄素得率的影响Fig.11 Effect of the amount of n-hexane on the yield of β-cryptoxanthin

2.5 正交试验优化超声皂化工艺的结果

由超声皂化工艺优化正交试验极差分析结果(表2)可知，对β-隐黄素得率的影响大小依次为:KOH浓度>超声时间>正己烷添加量>超声温度，优化的最佳超声皂化参数为A2B1C2D3，即在超声时间为1 h、超声温度为30 ℃、KOH浓度为1.5 mol/L、正己烷添加量为4 mL时β-隐黄素得率最高，为0.023 84%。由表3方差分析可知，对β-隐黄素得率的影响大小为超声时间、KOH浓度、正己烷添加量对β-隐黄素得率影响极显著，达到极显著水平，而超声温度对β-隐黄素得率有显著影响。

表2 正交试验结果

表3 正交实验方差分析表

注：*为显著，P<0.05；**为极显著，P<0.01。

3 结论及讨论

本试验对比分析了超声皂化与水浴皂化在不同时间的皂化效果，以β-隐黄素得率为评价指标。结果发现超声皂化比水浴皂化能获得更高的β-隐黄素得率，且能节约皂化时间，因此超声皂化比普通水浴皂化具有更好的皂化效果，这与赵伟研究的叶黄素超声皂化与水浴皂化结果相似[7]。研究了不同因素对β-隐黄素得率的影响，并选取超声时间、超声温度、KOH浓度、正己烷添加量等因素进行工艺优化，得出对β-隐黄素得率的影响大小为:KOH浓度>超声时间>正己烷添加量>超声温度，优化的工艺条件为：超声时间1 h、超声温度30 ℃、KOH浓度为1.5 mol/L，正己烷添加量为4 mL，β-隐黄素得率为0.023 84%，这一结果与王洪洋[14]、蒋国玲[11]等的报道基本吻合，但由于选取材料不同，材料中β-隐黄素含量有所差异，使得最终β-隐黄素得率有细微差异。经过皂化后β-隐黄素的含量得到很大提高，但需得到β-隐黄素纯品，还需进一步进行纯化，如进行过柱层析、结晶精制、制备液相分离等[15-17]。

超声波作为一种辅助提取手段，常用于辅助有机溶剂浸提生物活性物质，而将其用于皂化反应的尝试较少。本试验结果显示，将超声波用于皂化反应，能加速皂化反应的进行，提高目标物质得率，对生物活性物质的提取纯化具有重要意义。大多生物活性物质具有不稳定、易分解等特点，若能将超声波辅助法运用于生物活性物质的提取与纯化过程，将大大缩短其提取纯化时间，更有利于保护生物活性物质的原有性质。

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Study on ultrasonic saponification to extract β-cryptoxanthin

HUANG Qiao-juan，SHENG Ran，SUN Zhi-gao*，HAO Jing-mei

(Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)

Ultrasonic saponification was used to extract β-cryptoxanthin from powder of orange peel. Water bath and ultrasonic saponification was compared based on the yield of β-cryptoxanthin. The effects of saponification temperature, saponification time, KOH concentration, KOH-ethanol and n-hexane content on the amount of ultrasound saponification reaction were studied. The optimal conditions for the saponification of β-cryptoxanthin esters were determined by single factor experiment and orthogonal experiment. The results are as follows: compared with water bath saponification, ultrasonic saponification can shorten saponification time, improve β-cryptoxanthin yield. The optimal conditions for ultrasonic saponification are: ultrasonic time1h, ultrasonic temperature 30 ℃, KOH concentration 1.5 mol/L,n-hexane addition 1∶4. Under these optimal conditions, the β-cryptoxanthin yield reached 0.02384%.

water bath saponification; ultrasonic saponification; β-cryptoxanthin yield; process optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610034

硕士研究生(孙志高副研究员为通讯作者,E-mail:cpro@cric.cn)。

重庆市科技支撑示范工程项目(cstc2014fazktjcsf80034)

2015-10-14，改回日期：2016-03-22