辛烯基琥珀酸燕麦β-葡聚糖酯的合成

刘嘉，董楠，叶发银，赵国华 *

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(贵州省食品加工研究所，贵州 贵阳，550006) 3(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715)



辛烯基琥珀酸燕麦β-葡聚糖酯的合成

刘嘉1,2，董楠2，叶发银1,3，赵国华1,3 *

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(贵州省食品加工研究所，贵州 贵阳，550006) 3(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715)

近年来，多糖基表面活性剂的合成与功能性质的研究成为食品化学领域比较活跃的研究方向。文中以具有生物活性的燕麦β-葡聚糖为底物，利用辛烯基琥珀酸酐(OSA)为酯化剂，通过优化反应条件，合成辛烯基琥珀酸燕麦β-葡聚糖酯(OSG)。单因素试验结果显示，OSG的取代度随反应时间和OSA添加量的增加而提升，而随反应温度和燕麦β-葡聚糖浓度的增加呈先提升后降低的趋势。在此基础上，响应曲面试验表明，在OSA添加量一定的情况下(0.6 mL)，反应时间(X1)、燕麦β-葡聚糖浓度(X3)以及反应时间(X12)、反应温度(X22)、燕麦β-葡聚糖浓度(X32)的二次项对OSG的取代度有显著影响(P<0.05)。当反应时间为4.66 h，反应温度为45.6 ℃，燕麦β-葡聚糖浓度为2.18 mg/mL时，可获得最大取代度(0.038 2)的OSG。1H-NMR确认了OSG的成功合成。

燕麦β-葡聚糖；改性；取代度；响应曲面；核磁共振

通过酯化等反应可将长链烷基或脂肪酸酰基链导入亲水性多糖链中对其进行疏水改性。疏水改性后的多糖分子同时具备了亲水性和亲油性，可作为半合成高分子表面活性剂使用，一般称为多糖基表面活性剂[1]。与其他合成类表面活性剂相比，多糖基表面活性剂除具有优良的表面活性外，还具有良好的生物相容性、生物可降解性和较高的安全性等[2]。文献报道的通过疏水改性制备多糖基高分子表面活性剂的多糖主要包括淀粉[3]和糊精[4]。除此之外，一些其他天然来源多糖，如半乳甘露聚糖[5]、瓜尔豆胶[6]、阿拉伯胶[6]、透明质酸[7]和魔芋葡甘露聚糖[8]等都可作为多糖基高分子表面活性剂半合成的起始原料。在食品领域，辛烯基琥珀酸淀粉酯的合成及应用受到最多关注，且已被食品监管部门批准使用，并工业化生产。β-葡聚糖(β-Glucan)是广泛存在于细菌、酵母、真菌和植物(燕麦、黑麦和大麦等)当中的大分子多糖。现代医学和营养学的研究表明，谷物β-葡聚糖具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗癌、降低胆固醇、调节血脂和血糖等多种生理功能，已成为当前医药和食品领域研究与开发的热点[9]。理论上，可利用β-葡聚糖为底物通过半合成获得一种新型的多糖基表面活性剂。β-葡聚糖基表面活性剂可能不仅具有表面活性，还可能兼具生理活性，可能成为一种双功能高分子表面活性剂，但截至目前尚未见到有关这方面的文献报道。本文拟以辛烯基琥珀酸酐(OSA)作为疏水改性剂，通过半合成制备OS-燕麦β-葡聚糖酯(OSG)。重点探讨主要改性因素(燕麦β-葡聚糖浓度、反应温度和反应时间)对产物取代度的影响，并利用响应面对其予以优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦β-葡聚糖(80%)，张家口一康生物科技有限公司；2-辛烯基琥珀酸酐(97%)，美国Sigma-Aldrich公司；异丙醇(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；NaOH(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；HCl(分析纯)，重庆川东化工(集团)有限公司；三氟乙酸(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；乙腈(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；KBr(光谱纯)，天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

HJ-4A磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；LGJ-10，真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；AV 600核磁共振仪，瑞士Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 OSG的制备

将1.25～10.00 g燕麦β-葡聚糖分散于纯水中，置于磁力搅拌器上，在80 ℃下搅拌2 h。待充分溶解后冷却至室温，在3 000×g离心10 min。弃去沉淀，收集上清燕麦β-葡聚糖溶液备用。改性过程参考YUSOFF[10]等稍作修改。按照试验设计，将一定量(0.1～1.0 mL)2-辛烯基琥珀酸酐滴(OSA)加至100 mL燕麦β-葡聚糖溶液中，在一定温度(25～60 ℃)下反应一定时间(0.5～6 h)。反应过程中用30 g/L NaOH控制体系pH值在8～10。达到预定时间后，停止加热并自然冷却至室温后继续搅拌12 h。用2 mol/L HCl调节体系pH值至6.5左右，加入400 mL异丙醇(60 ℃)醇沉后，在3 000×g离心10 min，收集沉淀物溶解于纯净水中移至截留重均分子质量为14 000 g/mol的透析袋(MD 44-14, Union Carbide Co., Seadrift, TX, 美国)中对自来水和纯水各透析24 h。将透析内液置于真空冷冻干燥机中(冷阱温度-60 ℃，真空度100 Pa)干燥后备用。

1.3.1.1 反应时间对OSG取代度的影响

反应时间为0.5、1、2、4、6 h，其他反应条件为：燕麦β-葡聚糖浓度为2 mg/mL，反应温度为45 ℃，OSA添加量为0.6 mL。

1.3.1.2 反应温度对OSG取代度的影响

反应温度为25、35、45、55、60 ℃，其他反应条件为：燕麦β-葡聚糖浓度为2 mg/mL，反应时间为2 h，OSA添加量为0.6 mL。

1.3.1.3 燕麦β-葡聚糖浓度对OSG取代度的影响

燕麦β-葡聚糖浓度为1、2、4、6、8 mg/mL，其他反应条件为：OSA添加量为0.6 mL，反应时间为2 h，反应温度为45 ℃。

1.3.1.4 OSA添加量对OSG取代度的影响

OSA添加量为0.1、0.3、0.5、0.7、1 .0 mL，其他反应条件为：燕麦β-葡聚糖浓度为2 mg/mL，反应时间为2 h，反应温度为45 ℃。

1.3.2 响应面试验设计

采用Box-Behnken design (BBD)实验设计原理，结合单因素试验结果，考察反应时间(X1)、反应温度(X2)、燕麦β-葡聚糖浓度(X3)对OSG取代度的影响。试验因素的3个水平(-1，0，1)设置分别是：反应时间(X1)为2、4、6 h；反应温度(X2) 为35、45、55 ℃；燕麦β-葡聚糖浓度(X3) 为1、2、3 mg/mL。

1.3.3 OSG取代度的测定

OSG取代度(以trans-OSA计)的测定采用高效液相色谱仪进行测定，参考QIU等[11]方法，稍作改变。

1.3.3.1 OSA标准曲线的测定

准确称取0.100 0 g OSA置于25 mL试管中，并加入25 mL的NaOH溶液(4 mol/L)，于磁力搅拌器上，在室温下搅拌24 h。水解结束后，量取4 mL水解液加入到20 mL HCl溶液(1 mol/L)中，并磁力搅拌2 min。搅拌结束后，准确量取12、6、3、1.5、0.75 mL于25 mL具塞试管中，并添加乙腈至刻度。摇匀后静置30 min，取上清液待测。经HPLC测定，以trans-OSA浓度为横坐标(mg/mL)，以峰面积(mAu)为纵坐标绘制标准曲线。HPLC条件：色谱柱：C18；流动相：1 g/L三氟乙酸(TFA)/乙腈体积比45∶55；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测器：紫外检测器；检测波长：200 nm；柱温：30 ℃。根据文献[11]，选取trans-OSA作为定量峰。标准曲线为y(g)=-9.6×10-3+7.2×109x(R2=0.985 7)。式中y为OSA质量，x为trans-OSA在液相色谱图中的峰面积。

1.3.3.2 游离OSA的测定

准确称取干燥至恒重的OSG样品0.100 0 g于10 mL试管中，加入5 mL甲醇，于磁力搅拌器上在室温下搅拌1 h。然后，离心(3 000×g)并收集上清液1 mL。将1 mL 上清液与1 mL HCl溶液(pH=3)在漩涡混合器上混合1 min。取上清液测定。经HPLC测定，根据标准曲线计算含量，并计算样品中游离OSA的含量(OS游离%)，可按OS游离/%=(ρ1×10/m)×100计算，其中ρ1为经标准曲线计算所得浓度(mg/mL)，m为样品质量/g。

1.3.3.3 样品取代度的测定

准确称取干燥至恒重的0.050 0 g OSG样品于25 mL试管中，并加入10 mL NaOH溶液(4 mol/L)，于磁力搅拌器上，在室温下搅拌12 h。水解结束后，量取2 mL水解液加入到25 mL试管中，并加入10 mL HCl(1 mol/L)、13 mL乙腈，磁力搅拌2 min。搅拌均匀后静置30 min，取上清液经HPLC测定样品中总的OSA含量(OS总%)，可按OS总/%=(ρ2×125/m)×100计算，其中ρ2为经标准曲线计算所得浓度(mg/mL),m为样品质量(g)。由此可知由取代基团产生的OSA的含量(OS取代%)，即：OS取代/%=OS总(%) - OS游离(%)。OSG的取代度(DS)可按下式计算：DS=(162×OS取代%)/(100×210-209×OS取代%)。

1.3.4 核磁共振分析

将燕麦β-葡聚糖以及真空干燥的OSG溶于d6-DMSO后进行核磁共振分析。

1.3.5 数据处理

使用SPSS 19.0进行数据分析。方差分析用Tukey’s HSD进行分析，数据以(平均值±标准偏差)表示。使用Design Expert 7.0进行响应面试验设计及其方差分析。图表中以不同大写英文字母代表显著性差异(P<0.05为显著差异)。

2 结果与讨论

2.1 反应时间对OSG取代度的影响

如图1所示，当反应时间在0～4 h范围内，OSG的取代度随时间的延长而迅速增加。这是因为时间的延长增加了β-葡聚糖与OSA的接触机会。当反应时间从4 h延长至6 h时，取代度没有明显增加。这是因为在改性反应中β-葡聚糖酯化反应和OSG水解反应并存，且在改性初期(0～4 h)酯化反应占主导地位，而随产物合成量的增大，水解反应不断提升，最终二者在改性后期(4 h后)达到平衡[12]。

图1 反应时间对OSG取代度的影响Fig.1 Effects of reaction time on DS of OSG注：带有不同字母数值之间差异显著，P<0.05。

2.2 反应温度对OSG取代度的影响

如图2所示，反应温度在25～45 ℃之间时，随着温度的升高，取代度呈显著上升趋势。这主要是温度的升高使反应底物运动加速，增加了碰撞机会，提升了酯化反应速率。当反应温度继续从45 ℃升高到60 ℃，OSG取代度不但没有升高反而显著下降。这可能是因为过高的温度使OSG水解速率大幅提升并显著高于β-葡聚糖酯化反应速率的结果[13]。

图2 反应温度对OSG取代度的影响Fig.2 Effects of reaction temperature on DS of OSG注：带有不同字母数值之间差异显著，P<0.05。

2.3 燕麦β-葡聚糖浓度对OSG取代度的影响

如图3所示，燕麦β-葡聚糖浓度在1～2 mg/mL，随着燕麦β-葡聚糖浓度的升高，取代度呈上升趋势。在这一阶段，增加体系中β-葡聚糖浓度能够提高二者反应的机率，促进产物的取代度升高。继续增加燕麦β-葡聚糖浓度，取代度下降。这可能是因为增大燕麦β-葡聚糖浓度后，体系的粘度增大，OSA在体系中分散不均匀，使得酯化反应效率降低[12]。

图3 燕麦β-葡聚糖的浓度对OSG取代度的影响Fig.3 Effects of the concentration of oat β-glucan on DS of OSG.注：带有不同字母数值之间差异显著，P<0.05。

2.4 OSA添加量对OSG取代度的影响

如图4所示，随着OSA添加量的增加，取代度呈上升趋势。这可能是因为加大OSA的添加量使得燕麦β-葡聚糖与OSA的接触机会增加，进而取代度增大[12]。但是，实验中发现当OSA添加量超过0.6 mL后，就会造成产物的得率下降。虽然体系的pH能够通过向反应体系滴加碱来平衡，但随着OSA浓度的增加，体系中局部酸酐的浓度增大，可能使多糖链发生降解[13]。所以综合考虑到产物的得率和取代度，后期优化试验添加量选取0.6 mL OSA。

图4 辛烯基琥珀酸酐添加量对OSG取代度的影响Fig.4 Effects of the addition of OSA on DS of OSG.注：带有不同字母数值之间差异显著，P<0.05。

2.5 响应面优化试验结果与分析

按照Box-Behnken试验设计，分别选取不同反应时间处理(2、4、6 h) 、反应温度处理(35、45、55 ℃)以及燕麦β-葡聚糖浓度(1、2、3 mg/mL)作为优化试验的因素和水平。试验共实施17组，测得样品取代度的实际值和预测值见表1。

表1 取代度的响应面试验方案与结果

可以看出实际值与预测值间相差不大，证明模型拟合较好。对表1数据进行多元回归拟合，获得取代度的二次多项回归方程为：DS=-0.14+0.028 218X1+0.004 079X2+0.015 935X3+0.000 05X1X2+0.000 08X1X3-0.000 1X2X3-0.002 78X12-0.000 04X22-0.002 59X32。由方差分析可知，模型的P值极显著。拟合不足(Lack of Fit)检验的P=0.183 8(P>0.05)，模型失拟不显著，说明未知因素对试验结果干扰小，且R2=0.991 2说明模型拟合程度良好，试验误差小。

由表2的P值可知，反应时间、燕麦β-葡聚糖浓度、反应时间2、反应温度2、燕麦β-葡聚糖浓度2对取代度的影响极显著(P<0.05)，说明该设计中因素对响应值的影响不是线性关系。

表2 取代度的二次响应模型方差分析

A，反应温度和反应时间；B，燕麦β-葡聚糖浓度和反应时间；C，燕麦β-葡聚糖浓度和反应温度图5 因素间交互作用等高线图Fig.5 Interactive effects of reaction temperature, the concentration of oat β-glucan, and reaction time on DS of OSG.

如图5-A所示，在反应温度小于45 ℃时，随着反应温度的增加，产物取代度增加。反应温度大于45 ℃以后，取代度随着温度增加有降低的趋势。延长反应时间至5 h，产物取代度迅速升高。反应时间大于5 h后，产物取代度变化不大。如图5-B所示，在燕麦β-葡聚糖浓度小于2 mg/mL时，随着浓度的增加，产物取代度增加。进一步提高浓度则产物取代度下降。如图5-C所示，随着反应温度的升高和燕麦β-葡聚糖浓度的增加，产物取代度都呈现先上升后下降的趋势。

利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化，获得OSG合成的最佳参数条件为：反应时间为4.66 h，反应温度45.6 ℃，燕麦β-葡聚糖浓度为2.18 mg/mL。在次条件下实施3次验证试验，实测产物的最大取代度为(0.038 2±0.002 3)，与预测值(0.037 7)近似(相对误差1.3%)，无显著差异，这再次验证了优化控制方程的可适用性。

2.6 核磁共振(1H谱)分析

燕麦β-葡聚糖以及OSG的1H-NMR谱图如图6所示。在3.33 ppm和2.49 ppm附近的特征峰属于溶剂水分和DMSO。而在5.39，5.26以及4.65 ppm附近的特征峰分别属于葡萄糖分子上2-，3-以及6-C碳原子位上的羟基化学位移。在0.84 ppm附近的特征峰属于辛烯基中末尾碳原子上氢原子的化学位移[14]。在1.21 ppm附近的特征峰属于辛烯基中靠近末尾碳原子的3个碳原子上的氢原子的化学位移[14]。在1.98 ppm附近的特征峰属于靠近辛烯基中靠近双键的碳原子上的氢原子的化学位移[14]。

A，燕麦β-葡聚糖；B，C，D分别是取代度为0.008 0，0.017 2，0.0387的OSG图6 燕麦β-葡聚糖与OSG的核磁共振(1H)图谱Fig.6 1H Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of oat β-glucan and OSG with various DS.

3 结论

通过辛烯基琥珀酸酐疏水修饰燕麦β-葡聚糖，可获得携带辛烯基琥珀酰基的燕麦β-葡聚糖(OSG)。研究发现，OSG的取代度(但是)受酯化反应时间、燕麦β-葡聚糖浓度、辛烯基琥珀酸酐添加量、反应温度的控制。就反应时间(X1)、反应温度(X2)和燕麦β-葡聚糖浓度(X3)对DS的影响规律而言，遵循如下方程：DS=-0.14+0.028 218X1+0.004 07 9X2+0.0159 35X3+0.000 05X1X2+0.000 08X1X3-0.000 1X2X3-0.002 78X12-0.000 04X22-0.002 59X32。获得合成OSG最优化条件下为反应时间为4.66 h，反应温度45.6 ℃，燕麦β-葡聚糖浓度为2.18 mg/mL。此条件下产物取代度可达到0.038 2。推测OSG的1H核磁共振图谱在0.84、1.21 和1.98 ppm位置的特征峰应属于辛烯基中末尾碳原子上氢原子、靠近末尾碳原子的3个碳原子上的氢原子以及靠近辛烯基中靠近双键的碳原子上的氢原子的化学位移，这证实了OSG的成功合成。后续研究应加强OSG表面活性以及生物活性的评价，在此基础上进一步完成其安全性研究，为其在食品工业中应用奠定基础。

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Synthesis of octenylsuccinate oat β-glucan

LIU Jia1,2, DONG Nan2, YE Fa-yin1,3, ZHAO Guo-hua1,3*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Food Processing Institute of Guizhou Province, Guiyang 550006，China) 3(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

In recent years, the investigation on synthesis and functional properties of polysaccharide-based macromolecular surfactants became popular in the research field. In this study, octenylsuccinate oat β-glucan (OSG) was synthesized with bioactive oat β-glucan as substrate and 2-ocentyl succinic anhydride (OSA) as esterifying agent. The effects of reaction parameters on the degree of substitution (DS) of oat β-glucan were optimized successively by single-factor experiment and response surface methodology. The results of single-factor experiment revealed that DS of OSG increased with OSA amount and reaction time, and increase and then decrease with reaction temperature and concentration of oat β-glucan. Furthermore, the results of response surface methodology implied that reaction time (X1), concentration of oat β-glucan (X3) and quadratic?terms of reaction time (X12), reaction temperature (X22) and concentration of oat β-glucan (X32) showed significant impacts on DS of OSG (P<0.05). When reaction time, reaction temperature and concentration of oat β-glucan were settled as 4.66 h, 45.6 ℃ and 2.18 mg/mL, OSG with the highest DS (0.0382) was obtained. The1H-NMR spectra confirmed the successful synthesis of OGS.

oat β-glucan; modification; degree of substitution; response surface methodology; nuclear magnetic resonance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610016

博士，助理研究员(赵国华教授为通讯作者,E-mail：zhaoguohua1971@163.com)。

国家自然科学基金面上项目(31371737)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(cstc2014pt-gc8001)

2016-01-07，改回日期：2016-04-11