扫描电镜在果蔬保藏中的应用

陈妍竹，胡文忠，刘程惠，孙录，付喜庆，孙佩茗

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600)



扫描电镜在果蔬保藏中的应用

陈妍竹，胡文忠*，刘程惠，孙录，付喜庆，孙佩茗

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600)

随着扫描电子显微镜技术的发展，它已经被成功地应用于医疗、环境、生物、食品研究等各个领域，成为不可缺少的高科技辅助研究技术之一。近年来，越来越多的研究者们将它应用于果蔬保藏方面，以观察果蔬贮藏期内的组织表面形态变化以及微生物侵染果蔬表面过程。文章主要介绍扫描电镜在果蔬采后病害防治及鲜切果蔬保鲜两方面的应用现状，供未来研究者们研究果蔬保鲜及加工做参考。

扫描电子显微镜；果蔬；保藏；应用

扫描电子显微镜主要是利用电子束在样品表面进行逐点扫描，利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态[1]。因扫描电镜操作简单，图像分辨率高，所呈现的图像富有立体感，且视野广泛，景深长等特点，使其迅速成为各研究方向中必不可少的工具之一。扫描电镜在诸多领域中都有应用，例如在环境领域中可用于研究叶子表面颗粒物分布，研究不同植物的吸附能力[2]。在生物方面可用来观察昆虫表皮翅膀与甲壳[3]表面形态，橄榄果皮、角质层蜡及细菌粘附情况[4]，以及Gagaita果实提取物在不同烘干条件下粉末形态[5]。在无机化工材料中可观察纳米二氧化硅微粒以及纳米磷酸锌涂层[6]。在地质方面通过观察黑色页岩形态进一步分析其微观孔隙类型及演化过程等[7]。此外，它还在医学、矿物、冶金、电子材料等均有应用[8-11]。目前扫描电镜也已经作为辅助观察技术应用于果蔬加工及保鲜的研究中，本文将着重介绍扫描电镜在果蔬采后病害防治及鲜切果蔬保鲜方面的应用。

1 扫描电镜的发展及分类

1935年，扫描电子显微镜雏形初现，但在当时并不具有实用价值，2年后其理论获得完善，在1942年，Zworykinetal制成了第一台扫描电镜，分辨率为1 μm，10年后SEM分辨率已经可以达到50 nm，此后扫描电镜所具备的潜能受到重视。随着技术的发展与完善，1965年扫描电镜进入市场，进入一个全新发展的时期，此后其相关技术迅猛发展，1975年扫描电镜二次电子图像分辨率已达到6 nm，标志着扫描电镜进入了数字化时代，直至今日，扫描电镜已经成为一种全电子计算机控制、全自动图像分析的数字型扫描电镜[12]。

目前扫描电子显微镜主要分为五类，具体优缺点详见表1。其中生物样品研究中常使用常规扫描电子显微镜 (scanning electron microscope, SEM) 和环境扫描电子显微镜 (environmental scanning electron microscope, ESEM)，与环境扫描电镜相比，常规扫描电镜应用更为广泛。

2 扫描电镜在果蔬采后病害防治中的应用

由于果蔬本身属于鲜活农产品，水分含量较高且营养丰富，在采摘、包装、运输、贮藏中容易发生机械损伤而受到病原菌侵染，发生腐烂变质。因而人们使用化学杀菌剂、物理冷杀菌、生物防治及采用植物提取物对果蔬采后病害进行防治。其中生物防治及植物提取物控制采后病害由于其具有安全、有效等特点也成为近年研究热点之一。通过扫描电镜相辅助，可以深入研究采后病害防治机理，例如拮抗菌附着情况，拮抗菌与病原菌相互作用及它们的表面形态以及植物提取对病原菌丝影响等。

2.1 扫描电镜在拮抗菌控制果蔬采后病害中的应用

自然界存在大量微生物对采后病原菌生长有抑制作用，到目前为止，人们已经从果蔬土壤等分离到多种拮抗菌，这些拮抗菌包括酵母菌、细菌、小型丝状真菌[25]，其中以拮抗酵母菌应用最为广泛。USALL等人[26]通过普通扫描电镜观察苹果伤口处及表面酵母菌生长状况，图片直观表明伤口处内表面酵母菌生长迅速。而CHAN等人[27]通过普通扫描电镜对拮抗酵母菌与病原菌之间的相互作用进行具体分析，同时还证明2种不同拮抗酵母菌(Pichiamembranefaciens和Cryptococcusalbidus)对病原菌菌丝附着能力不同。研究者们结合扫描电镜研究草莓采前施喷拮抗酵母菌对采后贮藏性能及质量的影响[28-30]，通过扫描电镜图片都可看出未经酵母菌处理的对照组都有病原菌菌丝，而其他处理组没有，说明拮抗酵母菌可抑制病原菌菌丝体生长，其中毛淑波和WEI等人还通过扫描电镜证明酵母菌数量多少与采前施喷次数有关，采摘前0、3、6天施喷酵母菌更有利于其在果实表面定殖增长，该处理方法下酵母菌增殖数量最多。

表1 扫描电镜种类及其优缺点

除了使用扫描电镜观察单个拮抗菌的防治效果，扫描电镜也被应用于拮抗菌与物理方法复合控制果蔬采后病害。其中赵妍[31]通过扫描电镜观察不同处理组番茄果实伤口处病原菌生长情况，发现热空气38 ℃处理 24 h后病原菌菌丝数量显著减少，菌丝干瘪皱缩。酵母菌拮抗组与酵母菌复合热空气处理组均能观察到菌丝。说明，虽然复合热空气处理可以增强防治效果，但是仍不能杀灭病原菌。而ZHAO等人[32]在赵妍基础之上还研究热空气处理与酵母菌接种顺序问题，扫描电镜发现，接种酵母菌后再经空气热处理，虽然可以使病原菌菌丝体受损严重，但同时也使酵母菌表面凹陷，因此还是热空气处理后再接种酵母菌较适宜。拮抗菌控制果蔬采后病害目前研究多、应用广。菌本就属于微观世界，虽然普通显微镜也可对其进行观察，但是分辨率、成像质量、放大倍数都远不及扫描电镜，通过扫描电镜不仅可以观察酵母拮抗病原菌、还可观察病原菌侵入植物组织的过程[33]或者单种菌的生长繁殖过程，使采后病害的研究更加直观形象。

2.2 扫描电镜在植物提取物控制果蔬采后病害中的应用

利用植物提取物作为植源性杀菌剂，目前已成为国内外研究热点之一，并取得较大进展。研究者将扫描电镜应用于植物提取物控制采后病害的研究中。哈斯格根通过扫描电镜观察中草药北豆根提取物对灰葡萄孢菌与链格孢菌菌丝体的影响[34]，观察发现菌丝的形态与未处理组相比发生明显改变，并且随着中草药浓度的加大，菌丝形态皱缩，干瘪，扭曲，断裂，出现空腔，在最小抑菌浓度下，这2种病原真菌菌丝数量均有减少，在最小杀菌浓度处理下，菌丝数量进一步减少且大部分菌丝断裂，部分出现消融。冯武研究肉桂精油对链格孢菌丝生长的影响[35]，将扫描电镜与PDB培养基上肉眼观察菌丝生长形态相结合，微观与宏观相结合，使实验更具有可信度。在300 μL/L肉桂精油PDB培养基中，肉眼可见链格孢长势较差，菌丝颜色较浅，使用扫描电镜观察，该精油浓度下菌丝粗细不一，但菌丝表面光滑。在500 μL/L浓度下，链格孢生长量最少，菌丝球颜色变白，扫描电镜观察下菌丝少且干瘪，细胞内容物较少。通过扫描电镜，可以看出植物提取杀菌剂作用于病原菌菌丝体，使其结构遭到破坏，失去增殖侵染能力进而控制病害蔓延。

3 扫描电镜在鲜切果蔬中的应用

随着生活节奏的加快，鲜切果蔬因其方便、快捷、新鲜、营养等特点，深受人们的喜爱。但鲜切果蔬因轻度加工后，与正常完整的果蔬相比，更容易受到病原菌的侵染，也因在其加工中去皮、切分等使果蔬组织损伤，色泽发生改变[36]。扫描电镜很适合应用于鲜切果蔬方面，鲜切果蔬与普通完整果蔬的区别在于鲜切的组织是裸露在外，可通过扫描电镜观察其组织表面形态、切面光滑程度、细胞形态以及不同手段处理保鲜后表面情况。目前，国内对鲜切果蔬的研究大多停留在测定生理生化指标，国外则已经将扫描电镜应用于果蔬保鲜及加工改进的研究。

3.1 扫描电镜观察鲜切果蔬在贮藏时质量变化

在FUNDO研究鲜切甜瓜在贮藏期内的质量变化中[37]，扫描电镜作为组织表面分析的一种手段，观察鲜切甜瓜在0～6 d贮藏期内其表面变化，第0天，细胞排列紧密，细胞壁界限明显，但在贮藏期4天后，大部分细胞壁已经分解，其余细胞壁也已经扭曲变形，细胞排列杂乱无章。MISHRA在研究鲜切茄子褐变程度中通过扫描电镜发现[38]， 使用锋利刀片切割茄子会减少其物理性损伤，切割表面比较平滑，与肉眼观察鲜切茄子的褐变程度相结合可看出普通刀切割的茄子褐变程度明显高于锋利刀片切割的。说明目前扫描电镜既可以用于观察鲜切果蔬贮藏期表面变化，还可用于观察不同处理方式，例如加工方式、切割方式等对鲜切果蔬贮藏时期质量的影响。

3.2 扫描电镜在涂膜保鲜中的应用

扫描电镜还可以用于观察鲜切果蔬涂膜后表面形态。例如MARIA等人观察蛇果组织表面形态以及植物黏液、生育酚、纳米乳剂等不同膜处理后的表面形态[39]，其中组织表面的涂膜形态取决于分散成膜的粒度大小。VARGAS等人则观察3种不同膜(可食用壳聚糖，可食用壳聚糖+甲基纤维素，可食用壳聚糖+植物油酸)在正常大气压及真空浸渍下的鲜切胡萝卜表面区别[40]，在常压下进行涂膜，未被膜覆盖面积明显多于真空浸渍处理的，使用真空浸渍有较高的成膜质量，能均匀附着在鲜切胡萝卜表面，同时还观察了涂膜后鲜切胡萝卜薄片在常压及真空下的截面图，在真空处理下涂膜部分浸入组织中。AZARAKHSH等人通过扫描电镜观察可食用海藻盐结合3 g/L柠檬草精油处理鲜切菠萝[41]，在贮藏8 d后涂膜处理的鲜切菠萝表面形态与新鲜菠萝相差无几，但未处理的鲜切菠萝细胞壁瓦解，微生物显著生长，说明柠檬草精油结合涂膜处理可显著减少微生物生长，延长鲜切菠萝贮藏期。说明扫描电镜还可以成为鉴别涂膜保鲜效果好坏的一种手段，使对膜好坏的鉴定不在局限于宏观观察褐变程度、是否有菌生长，而是上升到微观世界，从成膜质量、抑菌效果、粒度大小等多方面分析。

3.3 扫描电镜在冷杀菌技术保鲜中的应用

扫描电镜在冷杀菌保鲜中也有一定的应用，既可以用于观察鲜切果蔬杀菌处理后表面形态，观察菌落减少情况，还可以观察杀菌处理后菌的表面形态，推测该种杀菌技术能否对此有效果。有研究者使用酸性或者碱性电解水处理鲜切香菜后，通过扫描电镜观察幸存的微生物种群[42]，其中经过酸性与碱性电解水组合处理的香菜表面微生物最少，且酸性与碱性电解水组合杀菌效果好于单独的酸性处理或弱酸性电解水处理。ALWI研究臭氧处理鲜切风铃椒可减少沙门氏菌、单增李斯特菌、伤寒沙门氏菌的数量中应用了环境扫描电镜[43]，通过臭氧处理该3种细菌的培养基，观察细胞处理前后形态，未处理细胞表面光滑完整，处理后的细菌细胞表面不规则，细胞壁破裂。说明臭氧处理可破坏细菌渗透压平衡使其钝化至灭活。MARTNEZ-SNCHEZ等人研究在光照条件下贮藏鲜切生菜对其质量影响[44]，在光照条件下贮藏10 d后，生菜表面气孔大都会张开，气孔张开则有利于叶片导水度及植物组织之间气体交换，在此方面研究，大多出版物只是说光照会促使气孔打开，促进气体交换，但是都没人使用扫描电镜对此验证，仅是测定空气组成与失重，猜测光照会影响气孔开度以及呼吸作用，但该作者则通过扫描电镜图片直接说明光照会促使生菜气孔张开，说明扫描电镜在鲜切果蔬各方面的研究是十分必要的，并且所呈现的图像清晰明确，让人一目了然。

4 展望

果蔬采后病害防治、保鲜及贮藏一直是一个研究热点，果蔬鲜切更是代表着一种新的生活理念，若在研究中结合扫描电镜，会使实验结果更加形象清晰。目前，在国外，扫描电镜已经作为一种普遍的技术手段，除了应用在物理化学材料，生物医学，电子材料方面，在果蔬采后病害防治、鲜切果蔬加工与贮藏[48-49]等多个方面都有应用，而在国内扫描电镜更多的还是应用于物理及化学材料观察方面，对果蔬采后病害防治方面以及植物生长中拮抗菌筛选方面也有涉及[45-47]，但在鲜切果蔬加工和保鲜方面应用较少。相信随着扫描电镜技术的发展及仪器的普及，扫描电镜不仅能在果蔬采后与鲜切果蔬的研究中得到广泛应用，还将更多地应用于食材新鲜度的鉴定、新型食品的开发[50]、产品质量鉴别、食品益生菌新物种鉴别等方面。根据各类扫描电镜优缺点，将不同种扫描电镜应用于其最适宜的方向，同时还可以将其与拉曼光谱仪，红外光谱仪相结合，为未来研究者们的深入研究提供更好的技术手段支持。

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Application of SEM in storage of fruits and vegetables

CHEN Yan-zhu,HU Wen-zhong*,LIU Cheng-hui,SUN Lu,FU Xi-qing,SUN Pei-ming

(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

With the development of scanning electron microscope technology, it has been successfully applied in the field of medical, environmental, biological research and so on. It has become one of the high-tech assistant research techniques. In recent years, more and more application are used in fruits and vegetables in order to observe the morphological change in tissue surface and process of microorganisms infecting fruits and vegetables. In this paper we discussed the application of SEM in control of postharvest disease and the storage of fresh-cut fruits and vegetables to provide

about fruits and vegetable fresh-keeping and processing.

scanning electron microscope (SEM);fruit and vegetable; preservation; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610047

硕士研究生(胡文忠教授为通讯作者,E-mail：hwz@dlnu.edu.cn)。

国家自然科学基金项目(31471923)；中央高校自主科研基金青年项目(DC201502020402)

2016-03-01，改回日期：2016-03-28