mTOR/VEGF信号通路与鼻息肉关系的研究

王枭维，白伟良，徐婷婷，谭海燕

（中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科，沈阳 110004）

mTOR/VEGF信号通路与鼻息肉关系的研究

王枭维，白伟良，徐婷婷，谭海燕

（中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科，沈阳 110004）

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及血管内皮生长因子（VEGF）B蛋白在鼻息肉组织中的表达情况，探讨mTOR/VEGF信号转导通路在鼻息肉发病过程中的作用。方法采用免疫组化SP法检测33例鼻息肉及12例鼻窦非炎性黏膜组织标本中mTOR及VEGFB的表达情况。结果在鼻息肉组中mTOR蛋白及VEGFB蛋白阳性表达率分别为78.79%及82.61%，免疫阳性细胞数及着色强度明显高于对照组（P＜0.05）。Spearman等级相关分析显示VEGFB与mTOR表达呈正相关（r=0.837，P＜0.01）。结论在人鼻息肉组织中，mTOR及VEGFB蛋白表达明显增高，表达呈正相关，提示了在鼻息肉的发生发展中，mTOR被激活，引起下游VEGFB表达增高，为研究鼻息肉的发生机制以及防治鼻息肉的临床工作提供新思路。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；血管内皮生长因子；鼻息肉

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鼻息肉是临床上常见的慢性鼻黏膜炎症性疾病，目前以手术治疗为主，结合糖皮质激素等药物治疗，但手术复发率较高，严重影响患者的生活质量，部分鼻息肉对糖皮质激素治疗有抵抗，保守治疗效果也不理想。雷帕霉素靶蛋白（mammalian ra⁃pamycin target protein，mTOR）是目前的研究热点，有研究［1］表明，活化的mTOR信号通路在缺乏Foxp3+ Tregs的鼻息肉组织中发挥重要作用。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）B基因是VEGF家族的成员之一，广泛存在于各种组织中。动物实验研究［2⁃4］表明VEGFB能促进血管生成，可能与激活内皮细胞一氧化氮合成酶有关。mTOR相关基因的表达与年龄增长有关，其中VEGFB作为下游基因，与年龄增长呈负相关［5］，而mTOR/VEGF信号通路在鼻息肉中的作用机制，目前尚不清楚。本研究采用免疫组化SP法分析检测mTOR及VEGFB在鼻息肉中的表达情况。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料：随机选取2011年至2013年在中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科住院行鼻内镜手术，且经术后病理诊断为鼻息肉的33例患者作为实验组，鼻腔鼻窦非炎性疾病患者正常黏膜12例为对照组。全部入组病例排除变应性鼻炎、哮喘等变态反应性疾病，排除高血压及糖尿病等慢性病史，近期无下呼吸道感染性疾病。

1.1.2主要试剂：兔抗人p⁃mTOR，VEGFB多克隆抗体（一抗）分别购自Santa cruz及Abcom公司，抗原修复液购自武汉博士德生物工程有限公司，内源性生物素阻断试剂盒，SP超敏试剂盒（山羊抗兔IgG，二抗）和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司产品。

1.2方法

所有标本常规做石蜡切片，经10%甲醛固定，石蜡包埋，用免疫组织化学SP法染片，采用微波修复进行抗原修复。血清及生物素阻断剂封闭。一抗4℃条件下孵育过夜，VEGFB及p⁃mTOR一抗工作液浓度分别为1∶160及1∶80。按试剂盒操作进行DAB染色。用已知阳性表达切片做阳性对照。PBS代替一抗做阴性对照。根据在400倍显微镜下随机选取5个视野中细胞的染色比例与染色强度进行评价：不着色记0分，着浅黄色记1分，着棕黄色记2分，着棕褐色及3分；染色面积＜5%记0分，5%～25%记1分，25%～＜50%记2分，50%～＜75%记3分，≥75%记4分，两者相乘为最终评分，0～2分为染色阴性，3～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性［6］。每张切片的阅读是由2位独立的观察者在不知道病例资料具体情况下完成的，最终结果由病理科医生审核。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料的差异比较采用χ2检验，相关分析行Spearman相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VEGFB在鼻息肉中的表达

VEGFB主要在细胞质呈阳性表达，部分位于细胞核，为棕黄色或棕褐色颗粒，主要表达于血管内皮、黏膜上皮和腺上皮，见图1A。VEGFB阳性表达率为82.61%，免疫阳性细胞数及着色强度明显高于对照组，见图1B，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2mTOR在鼻息肉中的表达

图1　免疫组化方法检测VEGFB的表达 ×400Fig.1　Immunohistochemistry staining of VEGFB protein×400

表1　VEGFB蛋白在鼻息肉和正常鼻黏膜组织中的表达Tab.1　The expression of VEGFB protein in nasal polyps and normal tissues

mTOR在细胞质中呈阳性表达，为棕黄色或棕褐色颗粒，主要表达于黏膜上皮、腺上皮和炎性细胞，见图2A。mTOR阳性表达率为78.79%，免疫阳性细胞数及着色强度明显高于对照组，见图2B，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3mTOR与VEGFB表达的相关性分析

Spearman等级相关分析显示，VEGFB与mTOR表达呈正相关（r=0.837，P＜0.01）。

3　讨论

鼻息肉是临床上常见的慢性鼻黏膜炎性疾病，发病机制至今尚未明确，普遍认为是多种因素共同作用的结果，如感染性因素、嗜酸性粒细胞浸润、细胞因子释放、变态反应因素以及基因调控［7］等，不同患者的致病因素可能不同。

图2　 免疫组化方法检测mTOR的表达 ×400Fig.2　Immunohistochemistry staining of mTOR protein　×400

表2　mTOR蛋白在鼻息肉和正常鼻黏膜组织中的表达Tab.2　The expression of mTOR protein in nasal polyps and normal tissues

mTOR是雷帕霉素的靶分子，属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶（phosphatidylinositol kinase⁃relat⁃ed protein kinase，PIKK）家族成员，是PI3K/Akt信号通路下游的重要底物。mTOR的Ser 2448位点可被Akt直接磷酸化，PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，使得下游包括mTOR、caspase9、NF⁃κB等一系列底物，从而抑制细胞凋亡［8］。该通路在过敏性呼吸道疾病的发展中起到显著的刺激作用［9］，而与鼻息肉相关的报道较少。本研究应用免疫组化SP法研究mTOR在鼻息肉中的表达，结果显示在黏膜上皮、腺上皮及炎性细胞有阳性表达，表达率为78.79%，免疫阳性细胞数及着色强度明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示了mTOR被激活后，鼻腔黏膜上皮细胞、黏膜下腺体内皮细胞以及炎性细胞凋亡受到抑制，黏膜上皮细胞增生，腺体扩大，炎性细胞浸润生长，趋化嗜酸粒细胞，减缓炎症消退，导致一种慢性炎性反应［10］，而VEGF作为PI3K/Akt/ mTOR的下游基因，其表达及活性有可能受到影响。文献报道鼻息肉中存在VEGFA的表达，可促使黏膜血管通透性增高，加重黏膜水肿，促进息肉组织内的血管增殖和炎性细胞聚集，促进鼻息肉的形成、生长及复发，使正常鼻黏膜向息肉组织转化。在患有哮喘的生物个体的多种组织样本中检测到高表达的VEGFA［11］，且VEGF的表达高低与哮喘患者病情程度密切相关［12］，可能是过敏性呼吸道疾病关键的调节因子［9］。而VEGFB在过敏性呼吸道疾病及鼻息肉中的表达情况，国内外未见相关报道。本研究应用免疫组化SP法研究VEGFB在鼻息肉的表达，结果显示VEGFB蛋白在黏膜上皮、腺上皮、血管内皮及炎性细胞有阳性表达，表达率为82.61%，差异有统计学意义（P＜0.05），提示了VEGFB被激活后，血管内皮细胞加强分裂增殖、新生血管增多，黏膜水肿加重，炎性细胞聚集，使正常鼻黏膜向息肉组织转化。

本研究还发现mTOR及VEGFB两者间表达呈正相关，有协同表达关系，提示在各种因素作用下，mTOR/VEGF信号通路激活，mTOR及VEGFB表达均增高，鼻腔黏膜细胞凋亡受到抑制，同时组织内的血管增殖和炎性细胞聚集，促进鼻息肉的形成、生长及复发，最终形成恶性循环，导致鼻息肉的形成。深入研究mTOR/VEGF信号通路对于鼻息肉的治疗及防止复发具有重要意义。

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（编辑于溪）

Expression of mTOR/VEGFB Signal Transduction Pathway in Nasal Polyps

WANG Xiaowei，BAI Weiliang，XU Tingting，TAN Haiyan
（Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTostudytheexpressionofmammalianrapamycintargetprotein（mTOR）andvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）B in nasal polyps，so as to explore the role ofmTOR/VEGFsignal pathway in the process of the formation of nasal polyps.MethodsTotally 33 nasal polyps tissues and 12 normal tissues were collected.Immunohistochemistry were used to detect the expression of VEGFB and mTOR in tissues of both group，and the expression differences were compared.ResultsImmunohistochemistry results showed that the number of positive stained cells and staining intensity of VEGFB and mTOR in nasal polyp tissues were higher than those of controls group（P＜0.05）.The positive expres⁃sion rates of mTOR and VEGFB were 78.79%and 82.61%，respectively.Spearman correlation test showed that there was a close correlation among VEGFB and mTOR expression in nasal polyp tissues（r=0.837，P＜0.01）.ConclusionThe expressions of VEGFB and mTOR are up⁃regulat⁃ed in nasal polyps，and there is a close correlation between them.

mammalianrapamycintargetprotein；vascularendothelialgrowthfactor；nasal polyps

R765.2

A

0258-4646（2016）11-0992-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.009

辽宁省科学事业公益研究基金（2013001010）；沈阳市科学技术计划（F11⁃264⁃1⁃07，F13⁃220⁃9⁃21）

王枭维（1987-），女，医师，硕士.

白伟良，E-mail：baiwl@sj⁃hospital.org

2015-12-07

网络出版时间：