葡萄籽原花青素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

白晓，罗莹，董想，冯艳玲，张文宇，万多，宋晓宇

（1.中国医科大学转化医学研究院，教育部医学细胞生物学重点实验室，沈阳 110122；2.沈阳医学院附属第二医院肾内科，沈阳 110035）

葡萄籽原花青素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

白晓1，罗莹1，董想1，冯艳玲1，张文宇1，万多2，宋晓宇1

（1.中国医科大学转化医学研究院，教育部医学细胞生物学重点实验室，沈阳 110122；2.沈阳医学院附属第二医院肾内科，沈阳 110035）

目的研究究葡萄籽原花青素对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法建立C57BL/6小鼠肝脏缺血再灌注模型。腹腔注射原花青素，给药量为每天20 mg/kg，注射3周。检测肝脏氧化应激水平以及炎性细胞因子释放水平。结果原花青素可降低缺血再灌注导致的谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性升高，减少肿瘤坏死因子α与白介素的释放，并提高组织的总抗氧化能力，降低丙二醛水平，从而改善缺血再灌注损伤状况。结论原花青素可以减少肝脏缺血再灌注的损害，可以作为一种预处理药物应用于临床。

葡萄籽原花青素；预处理；肝脏缺血再灌注

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肝缺血再灌注损伤是肝脏手术尤其是肝移植和肝切除中常见的病理现象［1］，炎性细胞因子和活性氧都是肝脏缺血再灌注损伤的关键诱因［2］。现阶段，一般认为使用抗氧化药物可以降低肝缺血再灌注损伤，从而改善肝缺血性疾病预后。原花青素是从葡萄籽中提取的，可以降低细胞内游离氧自由基，改善细胞氧化应激状况，在药理学与生理学领域具有广泛的应用价值［3⁃4］。体外实验［5］表明，原花青素可以在心肌细胞中清除因缺血再灌注而产生的过氧化氢以及氧自由基。本研究使用葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin，GSP）对小鼠肝脏缺血再灌注模型进行预处理，并评估其对肝脏损伤的改善作用。结果显示该方法有效地减轻了肝脏缺血再灌注损伤，并对肝功能的恢复有一定的促进作用。

1　材料与方法

1.1鼠肝脏缺血再灌注模型

使用C57BL/6近交系野生型雄性鼠（购自中国医科大学动物实验部），体质量为20～25 g。将其分成假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）和GSP预处理组（GSP组），每组8只，共24只。实验前，GSP组给予GSP（购自天津一方科技有限公司），剂量为每天20 mg/kg，连续给药3周；I/R组给予同等体积的生理盐水。I/R组与GSP组小鼠注射肝素（100 U/kg）后，使用显微血管夹夹闭肝动脉及门静脉以阻断全肝血流。缺血处理30 min，移开血管夹以进行再灌注，1 h后取肝组织检测急性损伤水平。sham组不进行缺血再灌注，其他处理同I/R组。

1.2肝细胞损伤检验

以血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）作为衡量肝细胞功能的标准。8 000g离心血液样品10 min，使用生化自动分析仪检测血液中的酶含量。

1.3ELISA和免疫印迹

取鼠的肝组织，PBS清洗后称重。粉碎匀浆后在4℃、1 800g离心10 min，取上清。使用EBIOSCI⁃ENCE鼠ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）和白细胞介素1（interleukin⁃1，IL⁃1）。

1.4肝细胞抗氧化能力检测

使用PBS制备组织匀浆，4℃、1 800g离心10 min，弃去不溶沉淀，使用上清液检测总抗氧化能力（total antioxidative capacity，T⁃AOC）与丙二醛（malo⁃ndialdehyde，MDA）水平以显示组织的氧化应激状况。试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司。

1.5统计学分析

使用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析。数据均以表示。不同组间的差异采用F检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1GSP可降低肝缺血再灌注损伤

经缺血再灌注处理后I/R组的ATL与AST活性比sham组显著升高（P＜0.01）。而与I/R组相比，GSP组ATL和AST活性均显著降低（P＜0.01）。见图1。

图1　GSP对ALT与AST活性的影响Fig.1　GSP affects the activity of ALT and AST

2.2GSP可以降低炎性细胞因子水平

缺血再灌注后I/R组TNF⁃α和IL⁃1浓度比sham组有明显升高（P＜0.01）。而与I/R组相比，GSP组TNF⁃α和IL⁃1浓度均显著降低（P＜0.01）。见图2。

图2　GSP对炎性细胞因子的影响Fig.2　GSP affects the pro⁃inflammatory cytokines level

2.3原GSP在肝脏缺血再灌注中的抗氧化作用

I/R组T⁃AOC较sham组明显降低，而MDA水平上升（P＜0.01）。经GSP处理后，T⁃AOC与MDA水平均回复到较正常水准（P＜0.01）。见图3。

图3　GSP调节组织氧化应激水平Fig.3　GSP regulates the level of oxidative stress

3　讨论

近年来，人们对天然植物提取物入药应用于临床治疗的关注日渐增多。而在具有生物学活性的植物提取物中，抗氧化剂始终是研究的重点。天然抗氧化药物主要包括某些酶类、维生素类、黄酮类以及一系列合成物（如二硫苏糖醇、丁羟甲苯等）。这些黄酮类/酚类天然抗氧化剂在抗炎、降血脂、抗溃疡、抗组织增生、预防肿瘤以及调节免疫方面，均具有广泛的药理学与毒理学活性［6⁃7］。已有研究［8］表明，反式白藜芦醇可用于肝脏缺血再灌注模型，并对肝细胞有一定的保护作用。从葡萄籽中提取的原花青素是一种天然的低毒性抗氧化剂，经吸收后在体内具有很高的生物学活性，对遭受损伤的细胞有保护作用［9］。

目前对于GSP在肝脏缺血再灌注损伤中作用的报道还较少，因此本研究使用GSP对小鼠肝脏模型进行缺血前处理，评估其对缺血再灌注损伤的改善状况。研究结果表明腹腔注射GSP每天20 mg/kg，连续注射3周，可有效降低肝脏缺血再灌注损伤。

本研究探讨了GSP在减轻肝脏缺血再灌注损伤中的作用机制。结果表明GSP可以调节T⁃AOC能力与降低MDA水平，从而减轻组织氧化应激。另外，本研究还发现GSP可以抑制细胞因子释放，进而减少细胞损伤，促进细胞存活。

综上所述，本研究表明GSP可以提高氧自由基清除率并抑制炎性细胞因子释放，从而减轻肝脏缺血再灌注造成的损伤，可能作为预防缺血再灌注的新型天然药物，具有广阔的临床应用前景。

［1］JAESCHKE H.Molecular mechanisms of hepatic ischemia⁃reperfu⁃sion injury and preconditioning［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，284（1）：G15-G26.DOI：10.1152/ajpgi.00342.2002.

［2］GOH GB，MCCULLOUGH AJ.Natural history of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Dig Dis Sci，2016，61（5）：1226-1233.DOI：10.1007/ s10620⁃016⁃4095⁃4.

［3］BAGCHI D，GARG A，KROHN RL，et al.Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA⁃induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmenta⁃tion，and peritoneal macrophage activation in mice［J］.Gen Pharma⁃col，1998，30（5）：771-776.

［4］TERRA X，MONTAGUT G，BUSTOS M，et al.Grape⁃seed procyani⁃dins prevent low⁃grade inflammation by modulating cytokine expres⁃sion in rats fed a high⁃fat diet［J］.J Nutr Biochem，2009，20（3）：210-218.DOI：10.1016/j.jnutbio.2008.02.005.

［5］LI SG，DING YS，NIU Q，et al.Grape seed proanthocyanidin extract alleviates arsenic⁃induced oxidative reproductive toxicity in male mice［J］.Biomed Environ Sci，2015，28（4）：272-280.DOI：10.3967/bes2015.038.

［6］SONG X，ZHANG N，XU H，et al.Combined preconditioning and postconditioning provides synergistic protection against liver isch⁃emic reperfusion injury［J］.Int J Biol Sci，2012，8（5）：707-718. DOI：10.7150/ijbs.4231.

［7］ZOU J，QI F，YE L，et al.Protective role of grape seed proanthocy⁃anidins against CCl4induced acute liver injury in mice［J］.Med Sci Monit，2016，22：880-889.

［8］SAHAR HK，COTTART CH，WENDUM D，et al.Postischemic treat⁃ment by trans⁃resveratrol in rat liver ischemia⁃reperfusion：a possi⁃ble strategy in liver surgery［J］.Liver Transpl，2008，14（4）：451-459.DOI：10.1002/lt.21405.

［9］BAGCHI D，SWAROOP A，PREUSS HG，et al.Free radical scav⁃enging，antioxidant and cancer chemoprevention by grape seed pro⁃anthocyanidin：an overview［J］.Mutat Res，2014，768：69-73.DOI：10.1016/j.mrfmmm.2014.04.004.

（编辑陈姜）

Protective Effect of Grape Seed Proanthocyanidin against Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury

BAI Xiao1，LUO Ying1，DONG Xiang1，FENG Yanling1，ZHANG Wenyu1，WAN Duo2，SONG Xiaoyu1
（1.Institute of Translational Medicine，Key Laboratory of Medical Biology，Ministry of Education，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Nephrology，The Second Affiliated Hospital，Shenyang Medical College，Shenyang 110035，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of grape seed proanthocyanidin（GSP）against hepatic ischemia and reperfusion injury（IRI）.MethodsTo build murine warm hepatic IRI model，C57BL/6 mice

30 min hepatic ischemia process，and then the mice were sacrificed after 1 h reperfusion.The mice were administered with GSP intraperitoneally 20 mg/kg for 3 weeks.Two pathways related to IRI includ⁃ing oxidative stress and pro⁃inflammatory cytokines release were examined.ResultsData showed that GSP could significantly reduce hepatic IRI by decreasing the activity of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase，lessening tumor necrosis factor⁃α and interleukin⁃1 expres⁃sion，enhancing tissue total antioxidative capacity and reducing malondialdehyde level.ConclusionGSP can protect liver against IRI，which can be used as pharmacological preconditioning in clinical practice.

grape seed proanthocyanidin；preconditioning；hepatic ischemia and reperfusion injury

R34

A

0258-4646（2016）11-0982-03

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.006

国家自然科学基金（31300963）；辽宁省自然科学基金（201302105）

白晓（1986-），女，助理实验师，硕士.

宋晓宇，E-mail：xysong@mail.cmu.edu.cn

2016-03-24

网络出版时间：