Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究

于紫燕，王春霞，孙琦，赵江月，2，张劲松

（1.中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005；2.浙江大学医院院附属第二医院眼科，杭州 310009）

·论著·

Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究

于紫燕1，王春霞1，孙琦1，赵江月1，2，张劲松1

（1.中国医科大学附属第四医院眼科，中国医科大学眼科医院，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005；2.浙江大学医院院附属第二医院眼科，杭州 310009）

目的利用Cre/LoxP系统建立晶状体组织特异性Msx2基因敲除小鼠模型，并初步研究其表型。方法设计基因敲除方案，获得条件基因敲除小鼠Msx2cko和对照野生型小鼠Msx2wt。通过PCR技术对小鼠或E10.5和E14.5胚鼠进行基因型鉴定，通过整胚LacZ染色鉴定Le⁃Cre重组酶活性，同时通过对P1小鼠晶状体组织行HE染色进行初步表型观察。结果通过基因型检测证实了Msx2基因敲除小鼠模型建立成功，LacZ染色显示Le⁃Cre重组酶特异性表达在发育中的小鼠胚胎形成晶状体板的表面外胚叶特定区域。Msx2cko P21小鼠表现为小眼球畸形，眼周至鼻线性脱毛。HE染色显示Msx2cko小鼠晶状体体积减小及晶状体茎形成。结论初步建立了Msx2条件性基因敲除小鼠模型，Msx2条件基因敲除后引起小鼠晶状体发育异常，小眼球畸形。

晶状体；条件基因敲除；小鼠；Msx2

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晶状体作为眼屈光间质，具有屈光和调节等重要功能。同时，晶状体在眼组织发育过程中也起着至关重要的作用。由于晶状体接近胚胎表面，易于进行实验操作，所以近1个世纪以来，各国学者对晶状体的发生发育进行了广泛深入的研究。

同源盒基因Msx（muscle segment homeobox）属于Hox基因家族成员，脊椎动物中已有3个Msx基因被识别，均为染色体上不相连续但结构极为相似的成员。Msx2基因位于5号染色体长臂5q34⁃q35，编码由263个氨基酸组成的蛋白质，它可以与核心转录复合物作用调节转录［1］。以往的研究［2］多集中在Msx2对颅骨、乳腺等组织发育的影响上，Doheny眼科研究所LIU等［3］首次发现Msx2是晶状体发育调控因子，过表达或缺失均引起晶状体发育异常、视网膜和视神经发育不全、小眼球畸形。研究［4］发现，Msx2过表达转基因小鼠中，Msx2过表达可抑制视网膜细胞增殖并诱导其凋亡，抑制发育的视泡背侧视网膜骨形态发生蛋白4（BMP4）表达，上调BMP7表达；在小鼠晶状体上皮细胞中，Msx2抑制细胞增殖和分化，触发凋亡［5］。Msx2传统基因敲除小鼠中，E10.5晶状体组织FoxE3mRNA表达下调，Sox2蛋白在晶状体中表达正常，但视网膜组织中其表达下降，Pax6蛋白及Six3蛋白表达正常。

本研究拟应用Cre⁃LoxP系统建立Msx2条件性基因敲除小鼠模型，需要2种转基因动物，一种是在靶向敲除基因组序列中引入LoxP序列的Msx2转基因小鼠［6］，另一种是通过Pax6启动子驱动的Cre转基因小鼠。在获得全身性携带Msx2条件性等位基因小鼠后，与Le⁃Cre转基因小鼠交配，并对子代通过基因型鉴定及Lac⁃Z染色进行验证，为后续表型研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物

亲代Msx2flox/flox小鼠（C57BL背景），Msx2flox/ flox ROSA26 Le⁃Cre小鼠和Le⁃Cre小鼠，均由美国南加州大学Yi⁃Hsin LIU教授赠予。动物饲养于恒温恒湿SPF级房间，喂以标准饲料。

1.2小鼠的饲养和繁殖

将亲代Msx2flox/flox小鼠（C57BL/6背景）与Msx2flox/flox ROSA26 Le⁃Cre小鼠杂交，获得基因型Msx2flox/floxROSA26 Cre（+/-）（敲除型Msx2cko）小鼠和Msx2flox/floxROSA26 Cre（-/-）（野生型Msx2wt）小鼠。以观察到母鼠体内阴道栓为受孕第1天标志计数胚胎时间，选择胚胎发育E10.5和E14.5的小鼠胚胎待用。在整个模型小鼠繁殖过程中，雄性和雌性小鼠以1∶4的比例合笼交配。实验均采用同笼出生的野生型小鼠和基因敲除小鼠。

1.3小鼠子代基因型鉴定

根据打靶载体构建时Flox区域设计的位置，利用PCR方法扩增野生型和敲除型基因片段，并根据基因片段长度或产物的有无判断小鼠的基因型。

1.3.1DNA提取及PCR鉴定基因型：取小鼠尾尖约0.5 cm，置于1.5 mL Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解缓冲液100 μL，55℃恒温箱孵育过夜。震荡组织并混匀，85℃加热1 h，获取小鼠基因组DNA，保存于4℃待用。

PCR反应引物由南加州大学合成，引物序列见表1。PCR反应体系：总计25 μL，其中Q反应液5 μL，PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.125 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，H2O 13.875 μL。 PCR扩增条件：94℃4 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃1min，35个循环；72℃10 min；4℃保温。

1.3.2Cre基因型鉴定：取E11⁃E14.5胚鼠的胎膜组织，获取胚鼠基因组DNA方法同1.3.1，保存于4℃待用。PCR反应引物，由南加州大学合成，引物序列见表1。PCR反应体系及扩增条件同1.3.1。Cre（+）PCR片段大小为380 bp。

表1　Msx2cko基因表型检测所需PCR引物Tab.1　PCR primers for Msx2 gene genotyping

1.4LacZ全胚染色

E10.5和E14.5小鼠胚胎标本取材，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗（5 min×3次）。X⁃gal染色液37℃黑暗中孵育过夜，待见到组织出现蓝染，即可终止染色。胚胎保存在4℃70%乙醇中。

1.5HE染色

将出生后1 d（P1）小鼠眼球组织切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化后，经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色10 min，伊红染液染色10 min。乙醇脱水，二甲苯透明，封片后光学显微镜下观察，并照相。

2　结果

2.1Msx2条件性基因敲除小鼠及转基因小鼠的基因型鉴定

PCR基因型分析：用Msx2引物a和b进行PCR扩增，扩增fl等位基因条带和野生型条带。如图1所示，Msx2野生型大小条带347 bp，Msx2条件性等位基因条带大小为381 bp。左一和左五泳道上方条带代表fl等位基因，下方条带代表野生条带，提示该小鼠基因型为Msx2fl/+；左二泳道可见1条381 bp的电泳条带，代表基因型为Msx2fl/fl；左三、左四泳道可见1条347 bp的电泳条带，代表基因型为Msx2+/+；左六为空白对照。Cre PCR片段大小380 bp，右一、右三为Cre+，右二、右四为Cre-。

2.2Le⁃Cre；R26R双转基因胚鼠LacZ染色

图1　鼠尾基因组DNA及Cre重组酶的PCR鉴定结果Fig.1　PCR results for the genotyping of mouse tail DNA exaction

E10.5胚鼠晶状体泡可分辨，出现特异性蓝染，眼周外胚叶也因Cre重组酶的表达出现蓝染，此时已可辨认视网膜色素层，但未见染色（图2A、2B）；E14.5胚鼠LacZ染色显示晶状体、角膜、结膜、眼睑及眼周至鼻皮肤的特异性蓝染（图2D），而对照小鼠无任何染色（图2C）。提示Le⁃Cre重组酶特异性表达在发育中的小鼠胚胎形成晶状体板的表面外胚叶特定区域。

图2　LacZ染色检测Le⁃Cre重组酶活性Fig.2　LacZ staining of mouse embryos

2.3Msx2条件基因敲除小鼠初步眼表型分析

比较Msx2cko出生后21 d（P21）小鼠（图3A）与Msx2wt小鼠（图3B）的眼球，可观察到显著区别。Msx2cko P21小鼠眼窝凹陷，眼睑及睑裂缩小，无睫毛，眼睑周围及眼角到鼻侧的线性脱毛。P1组织学切片HE染色可见，与Msx2wt小鼠（图3D）相比，Msx2cko小鼠（图3C）晶状体体积减小，纤维细胞核分布异常，晶状体纤维细胞有空泡形成，角膜与晶状体前部上皮细胞明显粘连，晶状体茎形成（图3C黑箭头所示）。

图3　Msx2cko及Msx2wt小鼠P21眼球外观及P1晶状体组织切片HE染色Fig.3　Phenotype of P21 mice and HE staining of P1 mice

3　讨论

小鼠Msx基因家族有3个成员：Msx1、Msx2和Msx3。Msx3只在中枢神经系统中表达，Msx1和Msx2多表达在间充质细胞与上皮细胞的交界处和存在细胞增殖的区域。在Msx1对心脏发育作用的研究［7］中，国外学者认为Msx1通过引起上皮细胞提前分化而使细胞失去增殖的能力，而Msx2的作用与Msx1的作用相似。传统基因敲除小鼠模型显示，Msx1-/-小鼠表现为颅骨和牙齿发育缺陷，并在生后由于腭裂致死［8］。Msx2-/-小鼠可成活，表现为外胚叶的缺陷，如牙齿发育不良、脱毛、乳腺及小脑发育不良，头盖骨骨化异常［9］。Msx1-/-；Msx2-/-小鼠在胚胎E14.5即死亡［10］。

传统基因敲除动物模型中，某些对生命活动至关重要的基因被完全敲除后，小鼠会出现胚胎致死或生后不久即死亡的现象，而条件性基因敲除技术是在Cre⁃LoxP系统介导下的1种位点特异性重组技术，使得对小鼠基因组的修饰处在时空可调控状态。本研究利用Cre/LoxP系统成功构建了Msx2条件基因敲除小鼠模型，通过Pax6第一启动子驱动Cre重组酶在眼外胚叶衍生组织——晶状体、角膜、结膜、眼睑表皮及泪腺组织特异性表达，从而选择性删除这些组织细胞中的Msx2基因，研究Msx2基因对这些眼组织发育的影响。通过对小鼠基因型的分析，明确了小鼠或胚鼠是否携带Msx2条件性等位基因和Cre重组酶基因，并通过LacZ染色对Cre重组酶的表达进行检测。LacZ染色结果显示了Cre重组酶与眼部组织的时空表达，同时也确定了其表达的组织特异性。

本研究成功建立了Msx2条件性基因敲除小鼠模型，为研究Msx2基因的功能和分子调控机制提供了可靠的体内实验模型。本研究发现Msx2基因敲除后，P21小鼠表现为眼窝凹陷，眼睑及睑裂缩小，无睫毛，眼睑周围及眼角到鼻侧的线性脱毛；P1小鼠晶状体体积减小，纤维细胞核分布异常，晶状体纤维细胞有空泡形成，角膜与晶状体前部上皮细胞残留粘连，晶状体茎形成，可能是与晶状体茎凋亡不足相关［11］。但Msx2基因在转录调控网络中的具体作用机制仍有待于进一步研究。

［1］SUN X，PARK CB，DENG W，et al.Uterine inactivation of muscle⁃segment homeobox（Msx）genes alters epithelial cell junction pro⁃teins duringembryo implantation［J］.FASEB J，2016，30（4）：1425-1435.DOI：10.1096/fj.15⁃282798.

［2］LIU YH，KUNDU R，WU L，et al.Premature suture closure and ecto⁃pic cranial bone in mice expressing Msx2 transgenes in the develop⁃ing skull［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（13）：6137-6141.

［3］WU LY，LI M，HINTON DR，et al.Microphthalmia resulting from MSX2⁃induced apoptosis in the optic vesicle［J］.Invest Ophthal⁃mol Vis Sci，2003，44（6）：2404-2412.

［4］ZHAO J，KAWAI K，WANG H，et al.Loss of Msx2 function down⁃regulates the FoxE3 expression and results in anterior segment dys⁃genesis resembling Peters anomaly［J］.Am J Pathol，2012，180（6）：2230-2239.DOI：10.1016/j.ajpath.2012.02.017.

［5］ZHAO JY，ZHUANG FF，WANG HY，et al.Msx2 plays a critical role in lens epithelium cell cycle control［J］.Int J Ophthalmol，2013，6（3）：276-279.DOI：10.3980/j.issn.2222⁃3959.2013.03.04.

［6］BENSOUSSAN V，LALLEMAND Y，MOREAU J，et al.Generation of an Msx2⁃GFP conditional null allele［J］.Genesis，2008，46（5）：276-282.DOI：10.1002/dvg.20390.

［7］LANIGAN F，GREMEL G，HUGHES R，et al.Homeobox transcrip⁃tion factor muscle segment homeobox 2（Msx2）correlates withgood prognosis in breast cancer patients and induces apoptosis in vitro［J］.Breast Cancer Res，2010，12（4）：R59.DOI：10.1186/bcr2621.

［8］YANG G，YUAN G，YE W，et al.An atypical canonical bone mor⁃phogeneticprotein（BMP）signaling pathway regulates Msh homeo⁃box 1（Msx1）expression duringodontogenesis［J］.J Biol Chem，2014，289（45）：31492-31502.DOI：10.1074/jbc.M114.600064.

［9］SATOKATA I，MA L，OHSHIMA H，et al.Msx2 deficiency in mice causes pleiotropic defects in bone growth and ectodermal organ for⁃mation［J］.Nat Genet，2000，24（4）：391-395.DOI：10.1038/ 74231.

［10］DAIJ，MOU Z，SHEN S，et al.Bioinformatic analysis of Msx1 and Msx2 involved in craniofacial development［J］.J Craniofac Surg，2014，25（1）：129-1234.DOI：10.1097/SCS.0000000000000373.

［11］ARYA P，RAINEY MA，BHATTACHARYYA S，et al.The endo⁃cytic recycling regulatory proteinEHD1 Is required for ocular lens development［J］.Dev Biol，2015，408（1）：41-55.DOI：10.1016/j. ydbio.2015.10.005.

（编辑王又冬）

Establishment of Msx2 Conditional Knockout Mice Model and Preliminary Study on the Phenotypes

YU Ziyan1，WANG Chunxia1，SUN Qi1，ZHAO Jiangyue1，2，ZHANG Jinsong1
（1.Department of Ophthalmology，The Forth Affiliated Hospital，The Eye Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Department of Ophthalmology，The Second Affiliated Hospital，Zhejiang University，Hangzhou 310009，China）

ObjectiveTo establish a Msx2 conditional knockout mousemodel and preliminary explore the phenotypes.MethodsThe knockout plan was designed and the Msx2cko homozygous mice with complete knockout ofMsx2and wild type control mice were obtained.Genotype type of mice and E10.5⁃E14.4 embryos were determined by PCR.The expression of Le⁃Cre from whole mount LacZ staining was visualized.Preliminary phenotype of Msx2cko mice were stained by hematoxylin⁃eosinand observed.ResultsThe mouse model of Msx2 knockout was determined through genotyping forMsx2andCre.LacZ staining showed Le⁃Cre recombinase was expressed in the specified ectoderm for lens placode forma⁃tion.TheMsx2conditional deletion causes adult eyes（P21）to be microphthalmia with missing fur and whiskers around the eye and snout.Hema⁃toxylin⁃eosin staining showed small lens size and persistence of the lens stalk.ConclusionThe mouse model of conditional knockout ofMsx2is established successfully.The lack of Msx2 in mutant mice results in the abnormality of lens formation and microphthalmia.

lens；conditional knockout；mice；Msx2

Q954.48

A

0258-4646（2016）11-0964-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.002

国家自然科学基金（81371003）；中国博士后科学基金（2015m570517）；沈阳市科学技术计划（F13⁃318⁃1⁃09）

于紫燕（1981-），女，主治医师，博士.

赵江月，E-mail：zhaojiangyue@hotmail.com

2016-04-27

网络出版时间：