原肌球蛋白3与雄激素受体配体结合域之间的相互作用

邱阳，陈晓雅，孙峥嵘，胡冰青，徐品一，崔磊，李玲

（中国医科大学附属盛京医院1.内分泌科；2.病毒室，沈阳 110004）

原肌球蛋白3与雄激素受体配体结合域之间的相互作用

邱阳1，陈晓雅1，孙峥嵘2，胡冰青1，徐品一1，崔磊1，李玲1

（中国医科大学附属盛京医院1.内分泌科；2.病毒室，沈阳 110004）

目的为明确雄激素对动脉粥样硬化的影响及机制，在单核细胞内筛选与雄激素受体结合的蛋白。方法将雄激素受体配体结合域（AR⁃LBD）做为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从男性单核细胞cDNA文库中筛选与AR⁃LBD相互作用的蛋白，进一步应用Pull⁃down、免疫荧光技术验证二者在体外的相互作用。结果从男性单核细胞cDNA文库中筛选出原肌球蛋白3（TPM3）与AR⁃LBD存在相互作用。在体外通过Pull⁃down实验证实了TPM3与AR⁃LBD的相互作用，进一步通过共聚焦显微镜检测免疫荧光确认TPM3与AR⁃LBD在293HEK细胞中重叠共表达。结论在男性外周血单核细胞内，TPM3与AR⁃LBD存在相互作用。

雄激素受体；原肌球蛋白；单核细胞；酵母双杂交；动脉粥样硬化

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雄激素在男性生殖和性功能、红细胞生成、肌肉和骨骼肌代谢中具有重要作用。近年来，雄激素对心血管系统的影响备受关注，但它与动脉粥样硬化的关系尚不明确。动脉粥样硬化形成过程中，巨噬细胞的浸润及泡沫细胞的形成是关键环节。既往的研究揭示，生理浓度的二氢睾酮可以抑制巨噬细胞的浸润及泡沫细胞的形成，提示雄激素在动脉粥样硬化的发生、发展中也可能发挥很重要的作用［1］。

雄激素必须与雄激素受体（androgen receptor，AR）结合才能发挥生理作用。AR是配体依赖的甾体类核受体超家族成员，与其他核受体的结构类似，包括3个主要的功能域：调节转录活性的N⁃端结构域（N⁃terminal domain，NTD）、DNA结合域（DNA⁃binding domain，DBD）、C⁃端配体结合域（ligand⁃bind⁃ing domain，LBD）。其中，DBD通过1个较短的铰链区与LBD相连，铰链区包含1个核定位信号（nucle⁃ar localization signal，NLS），在配体（雄激素）存在的情况下，能帮助AR进入核内，与DNA特定部位结合，从而介导靶基因的转录［2⁃3］。LBD区的配体依赖（ligand⁃dependent）的激活功能区2（AF2）是AR中已经明确的2个转录激活功能区之一。因此，研究AR⁃LBD区的作用及与其相互作用的蛋白，可能对揭示雄激素在动脉粥样硬化及其他激素相关疾病中的作用有重要的意义。

本研究利用酵母双杂交系统从男性单核细胞cDNA文库筛选与AR⁃LBD相互作用的蛋白，并进一步通过Pull⁃down实验及免疫荧光技术验证了二者在体外的相互作用。

1　材料与方法

1.1材料

男性单核细胞cDNA文库，酵母菌株AH109；CloneMinerⅡcDNA Library构建试剂盒，FastTrack MAG mRNA纯化试剂盒，Platinum Taq DNA聚合酶，Super ScriptⅢFirst⁃Strand合成系统，PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo试剂盒，PureLinkTMHQ Mini Plasmid DNA纯化试剂盒，Lipofectamine 2000，In⁃FusionTMAdvantage PCR Clon⁃ing Kit均购自美国Thermofisher Scientific公司；第三代Matchmaker Ga14双杂交系统（Matchmaker Ga14 yeast two hybridsystem 3）及pGEX4T2、pEGFP⁃C1、pDsRed⁃C1购自日本Clontech公司；BD克隆质粒pGBKT7，AD克隆质粒pGADT7，MagneGSTTMPull⁃down System试剂盒购自美国Promega公司。KOD⁃Plus⁃Neo聚合酶购自日本TOYOBO公司。所需的限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自日本TaKaRa公司。酸洗玻璃珠购自美国Sigma公司。引物合成及测序由中国上海Invitrogen公司完成。

1.2方法

1.2.1男性单核细胞cDNA文库的构建：应用Clone⁃MinerⅡcDNA构建试剂盒，对健康男性外周血分离的2.5×107单核细胞进行mRNA分离，反转录成cDNA后连接3种不同读框的adaptor，通过BP重组方法分别克隆进pDONR222载体，制备成1个初级cDNA文库。提取pDONR222混合质粒，通过LR重组到酵母双杂交载体pGADT7⁃DEST上，制备成酵母双杂交cDNA文库，并进行文库扩增和质粒抽提。

1.2.2构建pGBKT7⁃LBD重组质粒：以AR DNA为模板，利用PCR扩增获得AR配体结合域（AR⁃LBD）基因片段，设计用于扩增AR⁃LBD全序列的特异性引物：Forward，5′⁃CATGGAGGCCGAATCCTATGAA TGTCAGCCCATCTTTCTG⁃3′；Reverse，5′⁃GCAGGTC GACGGATCCTCACTGGGTGTGGAAATAGATGGG⁃3′。

1.2.3酵母双杂交筛选：将AR⁃LBD基因片段构建到含转录结合结合域的载体中（pGBKT7⁃AR⁃LBD），将其作为诱饵，对构建在含转录激活域的酵母表达载体上的男性单核巨噬细胞cDNA文库进行筛选。对筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。

1.2.4Pull⁃down实验：将PGADT7⁃TPM3建成含有GST标签的pGEX⁃TPM3。将AR⁃LBD序列克隆到含有c⁃Myc标签的pCDNA3.1载体上，按照Magne GSTTMPull⁃down System说明书进行操作，利用West⁃ern blotting技术分析相互作用的蛋白复合物。

1.2.5免疫荧光检测：采用SalⅠ和BamHⅠ限制性内切酶，通过酶切方法构建质粒pEGFP⁃AR⁃LBD及pDsRed⁃TPM3。AR⁃LBD引物为Forward，5′⁃GAATTCT GCAGTCGACTATGAATGTCAGCCCATCTTTCTG⁃3′；Reverse，5′⁃CTAGATCCGGTGGATCCTCACTGGGT GTGGAAATAGATGGG⁃3′。原肌球蛋白3（tropomyo⁃sin，TMP3）引物序列Forward，5′⁃GAATTCTGCAGTC⁃GACATGGCTGGGATCACCACCATCGAG⁃3′；Re⁃verse，5′⁃CTAGATCCGGTGGATCCCTACATCTCATT CAGGTCAAGCAG⁃3′。将pEGFP⁃AR⁃LBD和pD⁃sRed⁃TPM3共转染入293HEK细胞中，利用免疫荧光观察2种蛋白共表达情况。

本研究通过盛京医院伦理委员会批准，批准号为2014PS88K。

2　结果

利用酵母双杂交系统，在酵母细胞AH109中，用pGBKT7⁃AR⁃LBD从男性单核细胞cDNA文库中筛选出相互作用的蛋白TPM3。

将文库质粒PGADT7⁃TPM3用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后克隆到含有GST标签的pGEX⁃4T⁃2载体上，将重组质粒pGEX⁃TPM3转化入大肠杆菌TOP10中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，TPM3融合蛋白成功表达。Pull⁃down实验及Western blotting检测结果发现2种蛋白在体外发生直接的相互作用（图1）。

将pEGFP⁃AR⁃LBD和pDsRed⁃TPM3重组质粒共同转染至293HEK细胞中，通过共聚焦显微镜，观察到pEGFP⁃AR⁃LBD融合蛋白与pDsRed⁃TPM3融合蛋白在胞质中重叠共表达（图2）。

3　讨论

本研究应用酵母双杂交方法从男性单核细胞cDNA文库中首次筛选出TPM3与AR⁃LBD存在相互作用，在体外通过Pull⁃down实验证实了TPM3与AR⁃LBD的相互作用，通过共聚焦显微镜检测免疫荧光进一步确认TPM3与AR⁃LBD在293 HEK细胞中重叠共表达。

原肌球蛋白是细肌丝中与肌动蛋白结合的蛋白质，是由2条平行的多肽链组成的α螺旋构型二聚体。每条原肌球蛋白首尾相接形成1条连续链与肌动蛋白细肌丝结合，正好位于双螺旋微丝大沟中。在肌肉细胞，它们通过控制肌球蛋白头端结合到肌动蛋白丝调节肌肉收缩；在非肌肉细胞，原肌球蛋白在“细胞骨架”构成中起重要作用。原肌球蛋白在细胞移动、形态发生变化和胞质移动中可调节肌动蛋白丝的动态变化，因而对细胞迁移和侵袭、免疫细胞归巢、伤口愈合和癌细胞转移有重要作用［4］。

图2　免疫荧光重叠共表达检测Fig.2　Immunofluorescent co⁃localization test

人类有4个编码原肌球蛋白的基因：Tropomyo⁃ sin1（TPM1）、Tropomyosin2（TPM2）、Tropomyosin3（TPM3）和Tropomyosin4（TPM4）。TPM3基因编码原肌球蛋白α⁃3链（tropomyosin alpha⁃3 chain），作为原肌球蛋白家族中的一员，与横纹肌和平滑肌收缩系统中的肌动蛋白或非肌肉细胞中的细胞骨架肌动蛋白相结合。

近年来，在肿瘤相关研究［5］中发现，TPM3的表达异常与肿瘤的恶性程度及死亡率有关。Tm5NM1为TPM3的低分子量亚型，是非肌肉组织中的原肌球蛋白，在细胞骨架的原肌球蛋白在细胞迁移中的作用方面，迄今为止研究最多。研究［6］表明，Tm5NM1在细胞迁移、细胞质移动中决定细胞形态、张力纤维的形成和局部黏附作用，Tm5NM1过度表达导致张力纤维数目增加，伸展能力增强，细胞移动速度降低。应用蛋白组学方法发现人单核细胞系THP⁃1用oxLDL刺激后TPM3表达明显升高，提示TPM3可能在oxLDL参与动脉粥样硬化形成过程中也发挥作用。RAMAIOLA等［7］通过经皮冠状动脉介入治疗研究了急性心肌梗死患者冠状动脉内血栓成分的蛋白质组学变化，发现随着从心肌梗死发病到介入治疗间的时间不同，细胞骨架相关蛋白组（如β肌动蛋白、TPM3和TPM4）在3 h以内组和6 h以上组有明显差异，3 h以内组的冠状动脉血栓主要由血小板和纤维蛋白原组成，而6 h以上组的血栓中血小板成分减少，单核细胞、中性粒细胞及淋巴细胞成分增多，提示TPM3和TPM4可能与血栓中炎性细胞的迁移和黏附有关。

既往的研究［8］表明，生理浓度的二氢睾酮可以抑制单核巨噬细胞的浸润及泡沫细胞的形成，AR参与调节巨噬细胞的募集及浸润。单核巨噬细胞的迁移和募集在动脉粥样硬化的发生、发展中也起着非常重要的作用。本研究发现并证实了TPM3与AR⁃LBD存在明确的相互作用，基于TPM3为关键的细胞骨架蛋白，提示雄激素可能通过AR⁃LBD及与之相互作用的TPM3影响单核巨噬细胞的细胞骨架发生动态变化，从而在巨噬细胞浸润、迁移等过程中发挥重要的生理作用。本研究为阐明AR参与调节单核巨噬细胞的募集及浸润的机制提供了重要的理论依据。TPM3可能成为防治动脉粥样硬化发生、发展的重要靶点。而TPM3与AR⁃LBD在体内的作用有待进一步深入研究证实。

［1］QIU Y，YANASE T，HU HD，et al.Dihydrotestosterone suppresses foam cell formation and attenuates atherosclerosis development［J］. Endocrinology，2010，151（7）：3307-3316.DOI：10.1210/en.2009⁃1268.

［2］HELSEN C，DUBOIS V，VERFAILLIE A，et al.Evidence for DNA⁃binding domain⁃⁃ligand⁃binding domain communications in the an⁃ drogen receptor［J］.Mol Cell Biol，2012，32（15）：3033-3043. DOI：10.1128/MCB.00151⁃12.

［3］WILSON EM.Analysis of interdomain interactions of the androgen receptor［J］.Methods Mol Biol，2011，776：113-129.DOI：10.1007/ 978⁃1⁃61779⁃243⁃4_8.

［4］LEES JG，BACH CT，O’NEILL GM，et al.Interior decoration：tropo⁃myosin in actin dynamics and cell migration［J］.Cell Adh Migr，2011，5（2）：181-186.

［5］TAO T，SHI Y，HAN D，et al.TPM3，a strong prognosis predictor，is involved in malignant progression through MMP family members and EMT⁃like activators in gliomas［J］.Tumour Biol，2014，35（9）：9053-9059.DOI：10.1007/s13277⁃014⁃1974⁃1.

［6］BACH CT，CREED S，ZHONG J，et al.Tropomyosin isoform expres⁃sion regulates the transition of adhesions to determine cell speed and direction［J］.Mol Cell Biol，2009，29（6）：1506-1514.DOI：10.1128/MCB.00857⁃08.

［7］RAMAIOLA I，PADRO T，PENA E，et al.Changes in thrombus com⁃position and profilin⁃1 release in acute myocardial infarction［J］. Eur Heart J，2015，36（16）：965-975.DOI：10.1093/eurheartj/ ehu356.

［8］IZUMI K，MIZOKAMI A，LIN WJ，et al.Androgen receptor roles in the development of benign prostate hyperplasia［J］.Am J Pathol，2013，182（6）：1942-1949.DOI：10.1016/j.ajpath.2013.02.028.

（编辑王又冬）

Interaction of Tropomyosin Alpha⁃3 Chain with the Ligand⁃binding Domain of the Androgen Receptor

QIU Yang1，CHEN Xiaoya1，SUN Zhengrong2，HU Bingqing1，XU Pinyi1，CUI Lei1，LI Ling1
（1.Department of Endocrinology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Viral Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the possible role and mechanisms of the androgen receptor（AR）in atherosclerosis，we screened the protein that interacted with the AR ligand⁃binding domain（LBD）.MethodsA yeast two⁃hybrid system was adopted using the LBD as bait to find the new proteins，which may interact with the AR⁃LBD in a cDNA library of male peripheral blood monocyte.Then this interaction was further verified by Pull⁃down and co⁃localization experiment by immunofluorescence.ResultsWe found a novel protein tropomyosin alpha⁃3 chain which inter⁃acted with the LBD of the AR.The interaction of the AR⁃LBD with tropomyosin alpha⁃3 chain was confirmed by a glutathione S⁃transferase（GST）pull⁃down assay.Furthermore，co⁃localization experiments by fluorescent confocal microscopy revealed that the AR⁃LBD co⁃localized with tropomy⁃osin alpha⁃3 chain in 293HEK cells.ConclusionAn interaction between the AR⁃LBD and tropomyosin alpha⁃3 chain in male peripheral blood monocyte may provide insights into the role and mechanisms of the signaling pathway of the androgen⁃AR in atherosclerosis.

androgen receptor；tropomyosin alpha⁃3 chain；monocyte；yeast two⁃hybrid screen；atherosclerosis

R543.5

A

0258-4646（2016）11-0973-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.11.004

国家自然科学基金（81170779）

邱阳（1970-），女，副教授，博士. E-mail：qy_sunny@hotmail.com

2016-01-18

网络出版时间：