黄芪茎叶质量标准研究

丛晶男 张宇 赵宏 王宇亮 秦永丽 荣芳悦

摘要：目的 建立黄芪茎叶的质量标准。方法 采用薄层色谱法进行定性鉴别；采用药典法测定黄芪茎叶水分、总灰分、浸出物的含量，采用比色法测定总皂苷、黄芪多糖的含量，采用HPLC测定黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。结果 薄层色谱斑点圆整、清晰、重复性好；黄芪茎叶水分为6.24%～12.24%，总灰分为8.21%～10.55%，水溶性浸出物为12.12%～27.30%，醇溶性浸出物为6.89%～10.28%，总皂苷为23.74～26.52 mg/g，黄芪多糖为23.31～45.70 mg/g，黄芪甲苷为0.047%～0.18%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷为0.21%～0.26%。结论 所建立的方法简便快捷，重复性好，结果准确可靠，能有效控制黄芪茎叶质量，可作为黄芪茎叶质量的主要控制指标。

关键词：黄芪茎叶；薄层色谱法；比色法；高效液相色谱法；质量标准

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.023

中图分类号：R282.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0094-05

Abstract： Objective To establish quality standards for stem leaf of Astragali Radix. Methods A method of TLC identification was used for qualitative discrimination. The moisture， total ash and extracts contents of the stem leaf of Astragali Radix were determined by pharmacopoeia method. Total contents of astragaloside and astragalus polysaccharide were measured by colorimetry. The astragaloside Ⅳ and calycosin-7-O-β-D-glucoside contents were detected by HPLC. Results The spots of TLC were round and clear with good repeatability. The moisture contents of the stem leaf of Astragali Radix were between 6.24%–12.24%； the total ash was between 8.21%–10.55%； the water- solubility extracts were between 12.12%–27.30%； alcohol-solubility extracts were between 6.89%–10.28%； the total contents of astragaloside were between 23.74–26.52 mg/g； astragalus polysaccharide were between 23.31–45.70 mg/g； the astragaloside Ⅳ contents were between 0.047%–0.18%； the calycosin-7-O-β-D-glucoside were 0.21%–0.26%. Conclusion The method is convenient， fast and repeatable， and the results are accurate and reliable， which can be used to control the quality of the stem leaf of Astragali Radix effectively， and as the main index of the quality standard.

Key words： the stem leaf of Astragali Radix； TLC； colorimetry； HPLC； quality standard

黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge和蒙古黄芪A. membranaceus（Fisch.）Bunge var. mongholicus（Bunge）Hsiao的干燥根[1]。早在汉末时期，《名医别录》曾记载以黄芪茎叶入药，其味甘、辛，性平，入心、肝二经，具有生津止渴、舒筋活血、消肿疗疮等功效。其丰富的资源及良好的药用价值，使黄芪地上部分具有较好的开发利用前景。因此，本研究对不同采收期的9批黄芪茎叶的主要活性成分进行了定性、定量测定，旨为制定黄芪茎叶质量标准、开发黄芪地上部分、扩大药用资源提供依据。

1 仪器与试药

765紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；Waters-D600半制备型色谱仪，美国Waters公司，包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、Waters-2424蒸发光散射检测器、Empower色谱工作站；Agilent-1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司。

黄芪对照药材（批号120974-201311）、黄芪甲苷对照品（批号110781-201314，含量以95.8%计）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号111920-201304，含量以98.3%计），中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水（自制）；黄芪茎叶样品购于哈尔滨绿达生动物药业有限公司，由佳木斯大学药学院张宇教授鉴定，为膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge茎叶。样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄芪茎叶中黄芪甲苷的鉴别 黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下薄层鉴别法进行鉴别。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，紫外光灯（365 nm）下显相同的橙黄色荧光斑点。

2.1.2 黄芪茎叶药材的鉴别 黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下薄层鉴别法进行鉴别。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

2.2 检查

黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅸ测定法测定水分、总灰分，结果见表2。

2.3 浸出物

黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅩA水溶性浸出物及醇溶性浸出物测定法项下的冷浸法测定，结果见表2。

2.4 总皂苷含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备 黄芪茎叶粉碎过四号筛，取5 g（精确至l mg），用95%乙醇在索氏提取器中回流6 h，提取液蒸干，残渣用甲醇定容至10 mL，供纯化用。将上述提取液加于中性氧化铝柱上，再用50%甲醇50 mL洗脱，洗脱液蒸干，残渣以无水乙醇定容至100 mL，作为供试品溶液[2]。

2.4.2 标准曲线与线性关系考察 精密称取黄芪甲苷标准品4 mg，蒸馏水定容，得浓度为0.4 mg/mL黄芪甲苷标准品溶液。取黄芪甲苷标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别置于具塞试管中，水浴蒸干，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，密塞。70 ℃水浴恒温加热20 min，冷却，加冰醋酸5 mL，摇匀。用765紫外可见分光光度计在560 nm波长处测定，以黄芪甲苷质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程Y=0.078 9X-0.005 7，r=0.999 9，线性范围为0.04～0.2 mg。

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，连续测定6次，结果黄芪茎叶中总皂苷含量RSD=0.28%，表明精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h检测，结果黄芪茎叶中总皂苷含量RSD=0.22%，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批次样品，制备供试品溶液，平行6份，测定，结果黄芪茎叶中总皂苷含量RSD=1.81%，表明本方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品6份，每份约5 g，精密加入黄芪甲苷对照品约25 mg，按供试品溶液制备方法制备，结果见表3。黄芪茎叶中黄芪总皂苷平均回收率为98.88%，RSD=0.26%。

2.4.7 测定法 精确吸取黄芪茎叶定容液0.1 mL于具塞试管中，置水浴上蒸干，按标准曲线制作项下方法操作，用765紫外分光光度计测定吸光度，按线性方程求出X，再按以下公式计算黄芪茎叶中总皂苷含量。总皂苷含量（mg/g）=10-3XV定容÷5V样。

2.5 黄芪多糖含量测定

2.5.1 供试品溶液的制备 黄芪茎叶粉碎过四号筛，取4 g（精确至l mg）于圆底烧瓶中，加蒸馏水40 mL，回流提取2 h，过滤，残渣再加水40 mL，回流提取2 h，合并2次滤液，离心，上清液浓缩至干，残渣以蒸馏水定容至50 mL，作为供试品溶液[3]。

2.5.2 标准曲线与线性关系考察 精密称取无水葡萄糖标准品5 mg，蒸馏水定容得浓度为0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液。取葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于具塞试管中，加水至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，40 ℃水浴中保温15 min，冷却，用765紫外可见分光光度计在490 nm波长处测定，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y=12.650X+0.026 9，r=0.999 1，线性范围为0.01～0.5 mg/mL。

2.5.3 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，连续测定6次，结果黄芪茎叶中黄芪多糖含量RSD=0.31%，表明精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h检测，结果黄芪茎叶中黄芪多糖含量RSD=0.23%，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批次黄芪茎叶，制备供试品溶液，平行6份，进样测定，结果黄芪茎叶中黄芪多糖含量RSD=1.64%，表明方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品6份，每份约4 g，精密加入葡萄糖对照品约20 mg，按供试品溶液制备方法制备，测定结果见表4。黄芪茎叶中黄芪多糖平均回收率为98.93%，RSD=0.88%。

2.5.7 测定法 分别量取供试品溶液0.1 mL定容于10 mL容量瓶中，量取1 mL供试品溶液置于试管中，并分别加入1 mL蒸馏水。按标准曲线制作项下方法操作，用765紫外可见分光光度计在490 nm波长处测定，对照标准曲线计算黄芪多糖含量。

2.6 黄芪甲苷含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱：依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（32∶68）；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；ELSD漂移管温度：90 ℃；雾化器模式：加热（功率60%、36 ℃）；载气：N2；气流压力：40 psi。色谱图见图1。

2.6.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液， 0.22 ?m滤膜过滤，即得[4]。

2.6.3 供试品溶液的制备 黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下含量测定中黄芪甲苷供试品溶液制备方法制备，所得药液0.22 ?m滤膜过滤，即得。

2.6.4 标准曲线与线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液5、8、10、15、20 ?L注入液相色谱仪。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=2.3×104X+2.6×104，r=0.999 2，线性范围为2.5～10 ?g。

2.6.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液连续进样6次，结果黄芪甲苷峰面积RSD=1.71%，表明精密度良好。

2.6.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h检测，结果黄芪甲苷峰面积RSD=1.32%，表明样品溶液的稳定性良好。

2.6.7 重复性试验 取同一批次黄芪茎叶平行6份，进样测定，结果黄芪甲苷含量RSD=1.48%，表明方法的重复性良好。

2.6.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品6份，每份约4 g，精密加入黄芪甲苷对照品约5 mg，按供试品制备方法制备，测定结果见表5。黄芪甲苷平均回收率为98.96%，RSD=0.24%。

2.6.9 样品测定 取9批黄芪茎叶样品，按“2.6.3”项下方法处理，精密吸取供试品溶液20 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，用标准曲线方程计算。

2.7 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定

2.7.1 色谱条件 Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%甲酸为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，20%→40%乙腈；20～30 min，40%乙腈），流速1 mL/min，柱温20 ℃，检测波长260 nm，色谱图见图2。

2.7.2 对照品溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，0.22 ?m滤膜过滤，即得。

2.7.3 供试品溶液的制备 黄芪茎叶粉碎过四号筛，按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下含量测定中毛蕊异黄酮葡萄糖苷供试品溶液的制备方法进行制备，所得药液经0.22 ?m滤膜过滤，即得。

2.7.4 标准曲线与线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液5、8、10、15、20 ?L注入液相色谱仪。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=1.58×103X-2.23，r=0.999 5，线性范围为0.25～1 ?g。

2.7.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液连续进样6次，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD=1.56%，表明精密度良好。

2.7.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h检测，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD=1.41%，表明样品溶液的稳定性良好。

2.7.7 重复性试验 取同一批次黄芪茎叶平行6份，进样测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量RSD=1.64%，表明方法的重复性良好。

2.7.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品6份，每份约1 g，精密加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品约2 mg，按供试品溶液制备方法制备，结果平均回收率为99.27%，RSD=0.14%，见表6。

2.7.9 样品测定 取9批黄芪茎叶样品，按“2.7.3”项下方法处理，精密吸取供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，用标准曲线方程计算。

2.8 总皂苷、黄芪多糖、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定结果

9批黄芪茎叶样品中总皂苷、黄芪多糖、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分别为25.03 mg/g、35.63 mg/g、0.095%、0.24%，见表7。

3 讨论

本试验参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下的鉴别方法对黄芪茎叶进行定性鉴别，所得薄层色谱斑点圆整、清晰、重复性好。

2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定，黄芪药材的质量控制指标包括水分、总灰分、浸出物、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等，研究表明黄芪茎叶中还含有总皂苷、黄芪多糖等有效成分[5-6]，故本试验将这2种成分也作为黄芪茎叶的质量控制指标。

本试验对不同采收期的9批黄芪茎叶的主要质量控制指标进行了含量测定，根据测定结果，规定本品水分不得过15.0%，总灰分不得过12.0%，水溶性浸出物含量不得少于12.0%，醇溶性浸出物含量不得少于5.0%，总皂苷含量不得少于2.0%，黄芪多糖含量不得少于2.0%；参考2015年版《中华人民共和国药典》（一部）黄芪项下的要求，规定黄芪甲苷含量不得少于0.040%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得少于0.020%。

参考文献：

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[2] 王春怡，叶雪兰，李卫民，等.黄芪总皂苷提取物的质量标准研究[J].时珍国医国药，2012，23（1）：94-96.

[3] 苏玉顺，李艳君，赵方振，等.紫外-可见分光光度法在植物多糖含量测定中的应用[J].光谱实验室，2011，28（3）：1101-1107.

[4] Ha-Jeong Kwon， Jeehyun Hwang， Sun-Kyoung Lee， et al. Astragaloside content in the periderm， cortex， and xylem of Astragalus membranaceus root[J]. Journal of Natural Medicines， 2013，67（4）：850-855.

[5] 陈虎虎，龚苏晓，张铁军，等.黄芪茎、叶的化学成分和药理作用研究进展[J].药物评价研究，2011，32（2）：134-137.

[6] 马振平.黄芪叶化学成分及含量测定研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2014.