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浙江省余姚地区22个非综合征型耳聋家系遗传分析

2016-11-30彭光华王辉姚娟范文露唐霄雯郑斌娇薛凌吕建新管敏鑫

温州医科大学学报 2016年10期
关键词:证者杂合家系

彭光华,王辉,姚娟,范文露,唐霄雯,郑斌娇,薛凌,吕建新,管敏鑫,3

(1.余姚市人民医院 耳鼻咽喉科,浙江 宁波 315400;2.温州医科大学 Attardi线粒体生物医学研究院,浙江 温州 325035;3.浙江大学 遗传研究所,浙江 杭州 310058)

浙江省余姚地区22个非综合征型耳聋家系遗传分析

彭光华1,2,王辉2,姚娟2,范文露2,唐霄雯2,郑斌娇2,薛凌2,吕建新2,管敏鑫2,3

(1.余姚市人民医院 耳鼻咽喉科,浙江 宁波 315400;2.温州医科大学 Attardi线粒体生物医学研究院,浙江 温州 325035;3.浙江大学 遗传研究所,浙江 杭州 310058)

目的:对宁波市余姚地区22个非综合征型耳聋(NSHI)家系GJB2、GJB3、GJB6编码区以及线粒体基因突变分析,进行临床、遗传和分子特征分析评估。方法:调查对象来自于余姚市人民医院22个NSHI家系22名先证者及患病家属33名,听力正常者254例,且均未携带GJB2、GJB3、GJB6编码区以及线粒体基因致病突变。所有受检者均采集外周血并提取DNA,并对受检者GJB2、GJB3、GJB6基因编码区以及线粒体基因进行测序,结合患者听力学检查、耳聋相关突变热点基因检测以及患者家系资料进行综合遗传分析。结果:在来源于宁波市余姚地区的22个NSHI家系的33名患者中,发现携带有GJB2基因235delC单突变家系4例,GJB2双杂合突变家系2例,线粒体基因1555位点突变3例。在GJB3、GJB6编码区并未发现有致病突变。在这22个NSHI患者家系中,有27.3%的家系检测出携带有GJB2基因病理性突变;有13.6%的家系携带有线粒体12S rRNA基因1555A>G突变。据临床资料显示,6个携带GJB2基因病理性突变家系以及3个携带1555A>G突变家系的听力损失程度、发病年龄、耳聋外显率等都有差异。结论:GJB2基因以及线粒体12S rRNA基因1555A>G突变是浙江省余姚地区NSHI患者的主要相关基因,可能也存在其他未知基因与这2个基因相互协同作用,对患者表型产生影响。

非综合征型耳聋;GJB2;线粒体DNA;基因突变

耳聋是人类感觉系统障碍最常见的疾病之一,每500个婴儿中就有一个发生先天性听力损失或语前聋[1]。其中,80%的患者除耳聋外不伴有其他症状,称为非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing impairment,NSHI)。50%以上的耳聋是由遗传因素造成的,遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X-连锁以及母系遗传等[2]。GJB2基因异常被公认为遗传性聋最常见的病因,能导致常染色体显性和隐性NSHI,约占遗传性NSHI的50%[3],GJB3、GJB6 突变也可以引起耳聋[4-5]。GJB2基因编码缝隙连接蛋白-26(connexin-26,Cx-26),当发生病理突变时,表达出结构不正常的Cx-26,缝隙连接受损,钾离子回流进入内淋巴液的循环受到影响,导致Corti氏器的钾离子中毒从而引起感音神经性耳聋[6]。线粒体DNA(mito-chondrial DNA,mtDNA)突变是母系遗传性耳聋重要的分子遗传基础,而线粒体12S rRNA基因上的A1555G、C1494T以及tRNASer(UCN)基因上的A7445G、G7444A、7472insC、T7510C和T7511C均是与NSHI相关的热点突变[7-10]。

1 对象和方法

1.1 研究对象 本研究对象来自于余姚市人民医院耳鼻喉头颈外科门诊,所有患者临床资料以及外周血样采集均依据温州医科大学伦理委员会管理规定执行。对患者进行了详细的发病史调查和体格检查,确定患者是否具有其他临床表型、氨基糖甙类药物(AmAn)用药史以及是否有噪声接触史等其他导致耳聋的环境因素。对照组来源于课题组收集的听力正常人群样本254例。

1.2 方法

1.2.1 临床检查:本课题采用的听力学检查主要以纯音测听(pure tone audiometry,PTA)来判定患者听力损失程度(主要包括PTA、ABR、声阻抗及 DPOAE)。以听力水平的分贝(dB)值为单位记录PTA结果,并以频率500、1 000、2 000、4 000和8 000 Hz 的听阈平均值计算,根据标准对患者听力损失程度进行分类,分为5级:正常≤25 dB;轻度聋=26~40 dB;中度聋=41~70 dB;重度聋=71~90 dB;极重度聋>90 dB。PTA的听力曲线类型分为斜坡型(slope):听力损失主要以2 000~8 000 Hz为主,患者听力阈值水平随测试频率的升高而逐渐升高;平坦型(flat):也称全频听力下降型曲线,患者各声音频率的听力水平基本一致;上升型(rising):患者的低频听力250~1 000 Hz较差,随测试频率的升高听力阈值逐渐降低;谷型(valley):听力损失以500~2 000 Hz为主;切迹型(notched):仅单一频率处阈值明显升高,相邻频率正常或接近于正常;山型(ridge):中间频率阈值比两端至少低20 dB。

1.2.2 DNA提取:抽取家系成员外周静脉血2 mL于EDTA抗凝管中,采用DNA提取试剂盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0,Takara)进行全基因组DNA提取,-20 ℃保存备用。婴幼儿采集指尖或足底血,用滤纸吸取微量静脉血后使用酚氯仿手工法提取全基因组DNA。

1.2.3 耳聋相关基因热点突变分析:以提取的全基 因组DNA为模板,PCR扩增耳聋患者的GJB2、GJB3、GJB6基因编码区以及线粒体12S rRNA、tRNASer(UCN)基因。相应的PCR扩增信息见表1。PCR产物经纯化后送华大基因测序公司进行双向测序,测序结果与标准序列进行比对,以确定是否含有耳聋相关热点基因突变。

表1 GJB2、GJB3、GJB6基因编码区以及线粒体12S rRNA、tRNASer(UCN)基因扩增信息

2 结果

2.1 GJB2基因突变分析 在这22例NSHI患者家系中,发现了79G>A、109G>A、176del16bp、235delC、 299delAT、341A>G、368C>A、608T>C 8种突变。其中可能的病理性或致病突变包括176del16bp、235delC、299delAT[11-13]。在22例NSHI患者家系中有6个家系携带有这3种突变,235delC突变4例,复合双杂合突变2例。在这6个家系中235delC突变检出率最高,每个家系中均有患者检出该突变。在这22个NSHI家系中,GJB2基因235delC突变携总家系数的27.3%;其次是299delAT(占9.1%);176del16bp仅在一个复合双杂合家系中检出(占4.5%)。而在患者中发现的其他GJB2基因变异:79G>A、109G>A、341A>G、368C>A、608T>C均在对照组中有发现。对照组中还检测出了21G>A变异,同时也发现了2例携带有害突变235delC杂合突变。同时在样本组与对照组中均未检测出GJB3、GJB6基因的致病性突变(见图1)。

图1 GJB2基因突变检测

2.2 线粒体12S rRNA和tRNASer(UCN)基因突变分析

在这22例NSHI患者家系中有3个家系还检测出了线粒体12S rRNA基因1555A>G突变(见图2),并未在线粒体tRNASer(UCN)发现已知的致病性突变如:A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C、T7511C等。线粒体12S rRNA基因1555A>G突变作为已知的致病机制较为明确的可增强氨基糖甙类抗生素耳毒性的敏感性的位点,高度保守。当它发生A>G突变时,会与1494位点形成1494C-G1555碱基配对。研究[7]表明:A1555G突变所形成新的G-C碱基配对可以使线粒体DNA与氨基糖甙类药物结合更加容易。

图2 线粒体12S rRNA基因1555A>G突变检测

2.3 先证者临床资料分析 6个携带GJB2基因致病突变家系和3个携带线粒体12S rRNA 1555A>G突变的家系图见图3,临床资料见表2。NB150家系先证者I I I-2,男,16岁,先天性聋,双侧听力下降,左耳听阀91.2 dB,右耳听阀88.7 dB;先证者父母均有听力损失现象发生。NB152家系先证者I I I-1,女,13岁, 双测听力下降,先证者左耳听阀91.2 dB,右耳听阀 95.0 dB,其父母均表现为先天性聋哑;NB177家系先证者I I-4,女,56岁,幼年时期发病,有用药史,听力损失程度随年龄逐渐加重,先证者左耳听阀72.5 dB,右耳听阀75.0 dB,另有2个姐妹及一外甥女耳聋;NB184家系先证者I I I-7,男,47岁,自幼耳聋,中度听力损失,有一个兄弟及3个表弟表妹也发生听力损失现象;NB187家系先证者I I-3,男,47岁,先证者左耳听阀110.0 dB,右耳听阀120.0 dB,先天性极重度聋哑,妻子、孩子均表现为极重度耳聋;NB189家系先证者I I-3,男,32岁,先证者左耳听阀77.5 dB,右耳听阀80.0 dB,哥哥、妻子听力不好,但孩子听力情况正常;NB192家系先证者I I I-1,男,20岁,先证者左耳听阀66.6 dB,右耳听阀89.2 dB, 表现为重度耳聋,父母听力都有听力损失现象发生;NB194家系先证者I I I-2,男,32岁,4岁时感冒注射药物(具体药物不详)导致耳聋,左耳听阀79.2 dB, 右耳听阀76.7 dB,妈妈和一个阿姨有轻度听力损失现象;NB195家系先证者I I-2,男,62岁,左耳听阀50.0 dB,右耳听阀60.0 dB,双胞胎兄弟及一个妹妹均为先天性聋哑。

表2 9例携带致病突变先证者及患病家属临床资料分析

2.4 耳聋相关突变热点分析 GJB2基因突变可导致DFNB1和DFNA3,是NSHI最常见的原因。在NSHI患者中已经发现了100多种GJB2基因突变类型,突变范围几乎涉及该基因所有编码区域,突变形式包括剪切、无义突变、错义突变、插入及缺失导致移码突变等,这些突变在不同种族人群中的发生频率和分布情况差异很大。GJB2基因病理性突变包括有:30delG、35delG、35insG、167delT、176-191del16、235delC、299-300delAT、504insGCAA等。其中欧美人群中以30delG/35delG最为常见[14],犹太人的突变热点是167delT[15],蒙古人种是235delC[16],日本人突变热点是233delC[17]。GJB2基因编码的Cx26蛋白,属于缝隙连接蛋白家族,在耳蜗毛细胞中高丰度表达,与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道,这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用[18]。GJB2基因突变可在蛋白质的翻译、运输或半通道的装配水平上影响缝隙连接通道的形成或功能障碍,导致包括钾离子在内其他代谢产物的交换异常[19]。GJB2的缺乏可造成先天性听力损失,而缺失、框移、剪接和不稳定转录等涉及功能缺失的突变可能与综合征或成年后耳聋有关,并且决定于突变位点的重要性及替换氨基酸的性质[20-21]。

图3 9个NSHI患者家系图

本研究通过对浙江余姚地区22个NSHI患者家系进行常见耳聋致病基因筛查检测到GJB2基因上常见突变5种79G>A、109G>A、341A>G、368C>A、608T>C 8,致病突变3种176del16bp、235delC,299delAT。235delC会导致移码突变,产生无功能蛋白;176del16bp后,175位点后16个碱基丢失导致59号密码子移码,最终终止密码子提前至75号,也会产生无功能蛋白;299delAT导致Cx26多肽的CL区大部分缺失,TM3、EC2和TM4区完全缺失,使蛋白功能受损。本研究收集的GJB2基因突变患者家系中都检测出了235delC突变,且均表现为先天性听力损失,但听力损失程度及类型有差异。在2个GJB2基因复合杂合突变家系中,患者也都表现为先天性听力损失。

在这22个NSHI患者家系中有3个家系发现了线粒体12S rRNA 1555A>G突变。12S rRNA是氨基糖甙类药物性聋和NSHI有关的一个线粒体DNA突变热点。1555位点位于12S rRNA的高度保守序列。当出现突变时,12S rRNA的结构发生改变,与细菌蛋白核糖体的结构更相似,因此与氨基糖营类抗生素的亲和力更高。氨基糖普类抗生素与线粒体12S rRNA作用会抑制氧化磷酸化过程中的呼吸链蛋白合成,引起耳毒性。而在没有氨基糖营类抗生素的条件下,线粒体A1555G突变本身也可以造成蛋白质合成过程中的翻译异常而出现耳蜗中细胞内ATP的合成降低,离子泵失能而导致离子代谢的稳态被打破,从而出现了耳聋[22]。

3 讨论

对6个携带有GJB2基因致病性突变家系分析发现,其中有235delC杂合、235delC纯合、235delC与299delAT复合杂合突变、176del16bp与235delC复合杂合突变、176del16bp与299delAT复合杂合突变几种情况。综合临床资料,可以发现他们的临床表型具有一定差异。在NB187家系内的5名患病成员都是GJB2复合杂合突变,表现为极重度聋,但同样是携带有GJB2复合杂合突变的NB195家系成员的听力损失程度仅为中度。在NB150家系中,先证者父亲携带有235delC杂合突变,临床表现为中度耳聋,严重程度低于携带有235delC纯合突变的先证者,同时我们在对照组中也发现了235delC杂合突变,携带者听力损失并未受损。对单纯携带235delC纯合突变的患者分析,我们能够发现在他们的临床表型,包括听力损失程度、听力曲线类型等也有较大差异。提示在这些患者中可能存在其他基因或环境因素与GJB2基因协同作用影响了患者的临床表型。

对3个携带有线粒体12S rRNA 1555A>G突变家 系分析发现,他们并未携带有其他致病性线粒体基因突变,NB177家系母系成员耳聋外显率为44.4%,先 证者使用过氨基糖甙类药物,幼年发病,听力损失程度随年龄逐渐加重,表现为重度耳聋,另有两姐妹 和一个外甥女发病,用药情况未知;NB184母系成员系耳聋外显率为50%,患病家系成员听力损失程度 以轻、中度为主,患者陈述未用过氨基糖甙类药物;NB194家系中先证者出生时听力正常,4岁时发烧注射链霉素后发生听力损失现象,其母亲与姨妈均有轻度听力损失,用药情况不明,患者子女无听力损失现象,对该家系成员的信息采集不够完全,无法统计耳聋外显率。这些患者家系中母系成员的外显率较高,但有一定差异,父系成员很少有听力损失现象发生,符合母系遗传特征。患者用药情况、听力损失程度、发病年龄均有一定差异提示其他因素如AmAn、核修饰因子以及本研究发现的保守性指数较高的其他氨基酸变异也可能影响线粒体12S rRNA 1555A>G突变致聋的表型表达。

本研究从临床特点、家系关系、遗传学特征对 宁波市余姚地区的22个NSHI患者家系进行了综合分 析。在对他们进行耳聋相关热点筛查发现,有6个家 系携带有GJB2基因致病性突变,占27.3%;3个家系携带有线粒体12S rRNA 1555A>G突变,占13.6%。这可能是导致宁波市余姚地区遗传性NSHI的主要原因。可能是由于样本量不够多的原因,并未在这些家系中发现有GJB3、GJB6基因致病性突变。

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(本文编辑:吴彬)

The genetic analysis of patients with non-syndrome deafness come from twenty-two families in Yuyao, Zhe-jiang province

PENG Guanghua1,2, WANG Hui2, YAO Juan2, FAN Wenlu2, TANG Xiaowen2, ZHENG Binjiao2,

XUE Ling2, LYU Jianxin2, GUAN Minxin2,3. 1.Department of Otolaryngology, Yuyao People’s Hospital, Ningbo, 315400; 2.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035;3.Institute of Genetics, Zhejiang University, Hangzhou, 310058

Objective: To explore the clinical, genetic and molecular characteristics of twenty-two families with non-syndrome deafness in Yuyao area. This study focused on analyzing mutations of mitochondrial gene and coding sequence of GJB2, GJB3, GJB6 gene. Methods: The samples were 33 patients with non-syndrome deafness come from 22 families in YuYao People’s hospital, and 254 cases with normal hearing. DNA were extracted out from peripheral blood of all subjects. All samples’ GJB2, GJB3 and GJB6 gene encoding region and mitochondrial gene were analyzed by direct sequencing, audiological examination, genetic testing for deafness and pedigree data. Results: The sequencing results revealed that 4 families carried GJB2 235delC mutation, 2 families carried GJB2 compound heterozygous mutations accounted for 27.3% and 3 families carried mitochondrial 12S rRNA A1555G accounted for 13.6% in the 22 families with non-syndrome deafness. All families without pathogenic mutations in the GJB3 and GJB6 encoding region. According to clinical data, 6 families with GJB2 gene mutations and 3 families with 1555A>G mutations had different levels in hearing loss, age of onset, and the rate of hearing loss. Conclusion: GJB2 and mitochondrial 12S rRNA 1555A>G gene mutation are the main genetic inheritance for the patients with non-syndrome deafness in Yuyao area, there may also be other unknown genes or environmental factors to coordinated with GJB2 gene and mitochondrial 12S rRNA gene co-modulate the variable penetrance and expressivity of deafness.

non-syndromic deafness; GJB2; mitochondria DNA; gene mutations

R764.04

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.002

2015-11-18

国家青年科学基金资助项目(31401070,31100903);浙江省自然科学基金资助项目(Y2110399);宁波市自然科学基金资助项目(201301059);温州医学院科研发展基金资助项目(QTJ13017)。

彭光华(1975-),男,浙江宁波人,主任医师。

管敏鑫,教授,博士生导师,Email:gminxin88@gmail.com。

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