结直肠癌中CEACAM1、VEGF的表达及与血管生成的关系和意义

吴 涛，徐 亮，杨志惠

(西南医科大学附属医院，四川 泸州 646000)



结直肠癌中CEACAM1、VEGF的表达及与血管生成的关系和意义

吴 涛，徐 亮，杨志惠

(西南医科大学附属医院，四川 泸州 646000)

目的 观察癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、血管内皮生长因子(VEGF)在结直肠癌中的表达情况及与微血管密度(MVD)的关系和意义。方法 选择90 例行手术切除治疗结直肠癌患者的癌组织标本作为观察组， 50例结直肠腺瘤患者的组织标本作为对照组，随机从观察组中选取10例距肿瘤边缘>5 cm的正常结直肠黏膜组织标本作为正常组。采用免疫组织化学方法检测3组组织标本中CEACAM1、VEGF表达情况，并记录MVD值，对CEACAM1、VEGF表达情况与MVD关系进行相关性分析。结果 观察组中CEACAM1 、VEGF阳性表达率和MVD值均明显高于对照组和正常组(P均<0.05)。观察组中CEACAM1、VEGF的阳性表达率及MVD值与肿瘤分化程度、淋巴结有无转移、肿瘤临床分期、肿瘤大小、肿瘤浸润深度均有关系(P均<0.05)，与性别、年龄、肿瘤部位无明显关系(P均>0.05)。线性相关性分析显示，CEACAM1、VEGF和MVD均具有正相关性(P均<0.05)。结论 CEACAM1、VEGF的高表达及MVD的升高与结直肠癌的生物学行为和进展关系密切，通过调节CEACAM1、VEGF的表达可能抑制肿瘤的浸润和转移。

结直肠癌；癌胚抗原相关细胞黏附分子1；血管内皮生长因子；微血管密度；免疫组织化学技术

结直肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，病死率较高，这不仅与缺乏有效的早期诊断方面的生物学指标有关，还与不能阻断肿瘤的浸润和转移有关。结直肠癌是富于血管的肿瘤，间质的血管生成是结直肠癌生物学进展的重要因素。目前关于其血管的生成有较为肯定的结论，但是相关影响因素研究较少。因此，研究影响结直肠癌间质血管生成的有关因素，对于寻找结直肠癌早期诊断的生物学指标、预后判断的指标、靶向治疗的指标十分必要。癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)也称CD66，其有抑癌的作用，但是近年来也有学者认为其在不同肿瘤中可能具有促癌变进展的作用[1]，其还可能具有多种生物学行为，如促进血管的新生等[2]。血管内皮生长因子(VEGF)是经典的血管生成促进因子，可以促进间质血管生成[3]。白细胞分化抗原34(CD34)是血管内皮的特异性标志物，其表达阳性可以标记血管密度(MVD)，临床应用广泛[4]。目前CEACAM1、VEGF的表达及对血管生成的作用在结直肠癌发生、发展中的作用研究较少，因此本研究探讨了CEACAM1、VEGF在结直肠癌中的表达情况及与MVD的关系和意义，试图为寻找结直肠癌早期诊断、预后判断、靶向治疗的指标提供支持。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2011年1月—2012 年 12 月在本院住院的90 例行手术切除治疗结直肠癌患者的癌组织标本作为观察组，男50例，女40例；年龄29～83(54.3±11.6)岁，中位年龄55岁；高分化腺癌30例，中分化腺癌35例，低分化腺癌(包括黏液腺癌和黏液细胞癌)25例；无淋巴结转移49 例，有淋巴结转移41例(淋巴结转移为术后病理报告中肠周淋巴结、系膜淋巴结及系膜动脉结扎处淋巴结)。另选取50例结直肠腺瘤患者的组织标本作为对照组，男26例，女24例；年龄16～78 (57.6±11.5)岁，中位年龄58岁。随机从观察组中选取10例患者距肿瘤边缘>5cm的正常结直肠黏膜组织标本作为正常组，男6 例，女4例；年龄35～60(56.5±7.7)岁，中位年龄51岁。3组均排除伴风湿性免疫系统疾病、其他类型的恶性肿瘤者，应用免疫抑制剂及术前放化疗者。

1.2 试剂与方法 兔抗人CEACAM1多克隆抗体、VEGF购自美国Bioworlde公司，CD34、二抗、DAB试剂盒购自丹麦Dako 公司。采用Evision免疫组织化学染色法检测各组组织标本中CEACAM1、VEGF、CD34的表达情况，其中CEACAM1采用胰腺癌作阳性对照，VEGF和CD34采用结肠癌作阳性对照。

1.3 结果判定标准 CEACAM1 以细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞；VEGF以细胞浆和/或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞；CD34表达在血管内皮细胞，呈棕褐色颗粒染色为阳性。阳性表达率计算：每张切片随机选择10个区域，在40×10高倍镜视野下选取阳性细胞密度高者计数，计数阳性细胞数占实质细胞的百分比。无阳性细胞表达为0分；阳性表达率小于1%为1分；阳性表达率表达1%～10%为2分；阳性表达率>10%～30%为3分；阳性表达率>30%～60%为4分；阳性表达率>60%为5分[5]。染色的强度按照无、弱、中、强分为0分、1分、2分和3分。将两者标准分相乘表示阳性表达水平[6]：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～7分为阳性()，≥8分为强阳性()。将()计为阳性表达，将(-)(+)()归为阴性表达。微血管密度(MVD)的计数采用Weidner法[7]，以出现与邻近的微血管明显分离，染色(棕色)阳性的单个内皮细胞或者内皮细胞簇作为一个血管计数。在40倍显微镜下确定切片血管密度最高的区域, 即“热点”，然后在200倍的显微镜下用计算机扫描统计,选择血管密度最高的3个区进行微血管计数,然后取其平均MVD值作为微血管数。

1.4 统计学方法 实验数据均应用SAS 6.12统计软件进行统计分析。计数资料比较采用2检验，计量资料比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，并对数据进行线性相关性分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组CEACAM1和VEGF阳性表达率比较 CEACAM1和VEGF在正常黏膜中阴性表达；CEACAM1在观察组和对照组中的阳性表达率分别为53.3%(48/90)和26.0%(13/50)，VEGF在观察组和对照组中的阳性表达率分别为56.7%(51/90)和38.0%(19/50)。观察组CEACAM1和VEGF阳性表达率均明显高于对照组和正常组(P均<0.05)，对照组明显高于正常组(P均<0.05)。

2.2 各组MVD比较 观察组、对照组及正常组MVD分别为30.66±4.95，22.94±5.42，19.00±4.35。观察组MVD明显高于正常组、对照组(P均<0.05)，对照组明显高于正常组(P<0.05)。

2.3 观察组CEACAM1和VEGF表达与临床病理特征的关系 CEACAM1、VEGF阳性表达率与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肿瘤的临床分期、大小和浸润深度显著相关(P均<0.05)，与性别、年龄、部位无明显关系(P均>0.05)。见表1。

2.4 观察组MVD值与临床病理特征的关系 MVD值与肿瘤分化程度、淋巴结有无转移、肿瘤临床分期、肿瘤大小、肿瘤浸润深度均有关系(P均<0.05)，与性别、年龄、肿瘤部位均无明显关系(P均>0.05)。见表2。

2.5 观察组CEACAM1、VEGF表达与MVD相关性 线性相关性分析示，CEACAM1与MVD(r=0.47,P=0.0392)、VEGF与MVD(r=0.65,P=0.0012)均具有正相关性。见图1及图2。

3 讨 论

结直肠癌发病与多种基因和蛋白的表达失调有关，其中血管生成的相关蛋白表达升高被认为在肿瘤形成和进展中有重要作用，如VEGF的生成和分泌增多。其次标记血管生成的相关蛋白如CD31、CD34等在肿瘤中的表达也升高，其对促进肿瘤进展有重要意义。近年学者也关注CEACAM1在肿瘤形成中的作用。

CEACAM1最初被认为是调节细胞黏附作用的重要黏附分子，主要通过邻近细胞表达的N末端Ig区域进行调节[8]。近年龚道元等[1]研究认为CEACAM1的升高对肿瘤的诊断及进展有重要作用。Yurdakul等[9]研究显示，CEACAM1在肿瘤组织的血管内皮中常有表达，认为其是肿瘤新生血管的标志物。申宝鸣等[10]报道肠癌患者血清CEACAM1水平明显高于正常组，认为CEACAM1可能是早期诊断肠癌的指标。王媛媛等[11]认为，CEACAM1表达的上调与结肠癌发生发展密切相关。本研究结果显示，观察组CEACAM1阳性表达率明显高于对照组及正常组，证实CEACAM1在结直肠癌中高表达，可能促进肿瘤的发生和进展；CEACAM1的表达与肿瘤分化程度相关，提示CEACAM1参与肿瘤细胞的分化过程，其高表达时，可以使细胞向成熟过程中的分化形成障碍，更多细胞停留于幼稚阶段，此时细胞的异型性增大，腺管形成少，核的染色深，具有更明显的侵袭性生物学行为；CEACAM1的表达与淋巴结转移相关，提示CEACAM1可能促进肿瘤的淋巴道播散；CEACAM1的表达与肿瘤的大小和浸润深度相关，提示CEACAM1高表达可以促使肿瘤生长，使肿瘤的侵袭能力及对周围组织的破坏能力更强；CEACAM1的表达与肿瘤的临床分期相关，由于临床分期是临床治疗及预后判断的直接依据之一，因此意味着CEACAM1与预后有关联。本研究未发现CEACAM1的表达与性别、年龄、肿瘤部位有关，提示CEACAM1与结直肠肿瘤的发生关系不大，而与肿瘤发生后的进展有关，分析原因可能为CEACAM1是VEGF的一个结构效应器，其在血管内皮异常表达后，促使肿瘤细胞分泌VEGF。

表1 观察组中CEACAM1和VEGF表达与临床病理特征的关系 例(%)

表2 观察组中MVD值与临床病理特征的关系

图1 CEACAM1和MVD相关分析图

图2 VEGF和MVD相关分析图

VEGF是当今研究最多的血管生成因子，其可以诱导基质血管形成，也可以促进血管内皮细胞增殖，其表达与多种因子具有协同作用[12-13]。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤，VEGF水平都与血管生成密切相关[14-15]，其可引起血管内皮细胞分裂、重塑，使血管内皮细胞枝芽状生长，同时经血流冲击形成管腔[16-17]。本研究结果显示，观察组VEGF阳性表达率和MVD值均明显高于对照组和正常组，提示VEGF和MVD在正常结直肠黏膜上皮细胞不典型增生、癌变及肿瘤性进展中起重要促进作用；VEGF阳性表达率和MVD值与肿瘤分化程度、淋巴结有无转移、肿瘤临床分期、肿瘤大小、肿瘤浸润深度均有关系，与性别、年龄、肿瘤部位均无明显关系，提示血管生成参与肿瘤的进展过程。

线性相关性分析显示，观察组中CEACAM1和MVD、VEGF和MVD均具有正相关性，提示CEACAM1、VEGF均对MVD具有促进作用，由于MVD直接反映间质血管密度及血管生成情况，因此CEACAM1、VEGF与MVD的相关性也反映出CEACAM1、VEGF对间质血管生成的促进作用，即CEACAM1、VEGF高表达时，可以在一定程上促进MVD高表达，从而使肿瘤间质血管生成更明显，肿瘤细胞生长更活跃，肿瘤体积增大，侵袭性更强。肿瘤血管生成涉及较多的调节机制及作用，CEACAM1可能是始动因子，其直接调节血管生成的作用可能不大，而是通过对VEGF的调节，使血管生成作用更明显、更直接。VEGF不仅可以直接启动血管新生，而且还可以通过对其他相关因子的调节启动血管生成，如VEGF可以通过ST2/eNOS信号通路刺激内源性NO产生，进而促进血管生成，同时使血管壁的通透性增强。在体外研究中，VEGF能诱导内皮细胞的增殖，同时促进内皮细胞的迁移，加速毛细血管的网格形成，有效促进血管的形成及血管功能的重建[18]。目前针对血管生成的靶向治疗使临床治疗效果明显增加。

综上所述，CEACAM1、VEGF的高表达及MVD的升高与结直肠癌的生物学行为和进展关系密切，本实验结果虽然无大样本及相关临界指标来进行预后的评估指导，但显示CEACAM1、VEGF和MVD在预后评估中有关联性，可以在以后继续进行大样本量的观察及随访，以期为判断结直肠肿瘤的生物学行为和预后提供更合理的指标，为靶向药物治疗寻找新的途径。

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Expression of CEACAM1 and VEGF in colorectal carcinoma and its relationship with angiogenesis

WU Tao, XU Liang, YANG Zhihui

(The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China)

Objective It is to observe the expressions of cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1 (CEACAM1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in colorectal cancer, and investigate their relationship and significance with micro-vascular density (MVD). Methods 90 cases of cancer tissue specimens of colorectal cancer patients with routine surgical resection were selected as the observation group, 50 cases of adenoma specimens of colorectal adenoma patients were selected as the control group, and 10 cases of normal colorectal mucosa tissue from the tumor edge >5 cm were randomly selected form the observation group as normal group. The expression of CEACAM1 and VEGF in the tissues specimens in the 3 groups were detected by immunohistochemical method, and the MVD value was record, the relationship between the expression of CEACAM1 and VEGF with MVD were analyzed. Results The positive expression rate of CEACAM1 and VEGF, and the value of MVD in the observation group were significantly higher than those in the control group and the normal control group (allP<0.05). The positive expression rate of CEACAM1 and VEGF, and the value of MVD were significantly associated with the differences of clinical pathological features as degree of tumor differentiation, lymph node metastasis, tumor staging, tumor size, and depth of tumor invasion (allP<0.05), but were not correlated with ages, sex and neoplasm location (allP>0.05). Linear correlation analysis showed that there was a positive correlation between CEACAM1 and MVD, VEGF and MVD in the observation group (allP<0.05). Conclusion The higher expression of CEACAM1 and VEGF, and the higher value of MVD is closely related to the biological behavior and progression of colorectal cancer, the regulate’s associated study of CEACAM1 and VEGF may influence invasion and metastasis, may offer new target index on treatment. The regulation on CEACAM1 and VEGF expression may inhibit the invasion and progression of tumor.

colorectal adenocarcinoma; cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1; vascular endothelial growth factor; micro-vascular density; immunohistochemical method

吴涛，男，硕士研究生，副主任医师，研究方向为胃肠外科。

徐亮，E-mail:xul1104@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.33.006

R735.37

A

1008-8849(2016)33-3666-04

2016-07-10