沉默肌瘤基质成纤维细胞FAP基因可抑制雌激素的细胞增殖效应

罗 宁，杨娟娟，郭 静，陈 丽，程忠平

(1.同济大学附属杨浦医院妇产科 同济大学医学院妇科微创医学研究所，上海 200090；2.苏州市吴江区第一人民医院，江苏 苏州 215200)



沉默肌瘤基质成纤维细胞FAP基因可抑制雌激素的细胞增殖效应

罗 宁1，杨娟娟2，郭 静1，陈 丽1，程忠平1

(1.同济大学附属杨浦医院妇产科 同济大学医学院妇科微创医学研究所，上海 200090；2.苏州市吴江区第一人民医院，江苏 苏州 215200)

目的 观察成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达在雌激素对子宫肌瘤基质成纤维细胞的活化和促增殖中的作用。方法 采用免疫磁珠法分离成纤维细胞并检测雌激素受体(ER-α/ER-β)表达情况。以雌激素分别刺激子宫正常平滑肌基质成纤维细胞及子宫肌瘤基质成纤维细胞(TAF)，并检测FAP、细胞外基质(ECM)、生长因子的分泌情况和细胞增殖活力的改变，以及检测细胞增殖通路相关信号分子的改变；使用RNAi技术沉默TAF的FAP基因，观察雌激素刺激对TAF上述指标表达水平的影响。结果 TAF的FAP、ER-α/ER-β的表达水平高于成纤维细胞(n=10，P<0.05)。经雌激素刺激，成纤维细胞和TAF的 FAP、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen I)和生长因子(TGF-β、IGF-1)表达水平，细胞增殖活力、细胞增殖通路相关信号分子(AKT、ERK、c-Fos、MEK)的磷酸化水平均上调；RNAi沉默FAP基因可抑制雌激素介导的上述生物学作用。结论 FAP基因表达是E2活化及促进子宫肌瘤基质成纤维细胞增殖过程中的关键，其可能在子宫肌瘤发病机制中具有重要作用并且可能成为治疗子宫肌瘤的新靶点。

子宫肌瘤；成纤维细胞；肿瘤相关成纤维细胞；雌激素；成纤维细胞活化蛋白

子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，常见的临床表现为子宫异常出血，腹部肿块及压迫症状，不孕与流产等，严重影响女性健康[1]。子宫肌瘤生长表现为激素依赖性，雌激素在子宫肌瘤的发生和发展过程中有重要作用[2-3]。

有研究表明，肿瘤微环境为肿瘤细胞的发生发展提供了一个良好的环境，成纤维细胞是肿瘤微环境中最主要的基质细胞[4]。不同于正常组织中的成纤维细胞，肿瘤组织中的成纤维细胞约有80%处于持续活化状态，也称为肿瘤相关成纤维细胞(tumor association fibroblasts，TAF)[5]。活化的成纤维细胞特征性改变表现为表达成纤维细胞活化蛋白(fibroblasts activation protein，FAP)。FAP不仅是成纤维细胞活化后特异表达的标记物，还参与了肿瘤生长的调控[6]。因此，FAP有望成为抗肿瘤药物研究的靶点。

目前，成纤维细胞与子宫肌瘤发生的关系存在诸多未知，雌激素促子宫肌瘤发生的作用机制也有待进一步探究。本研究分离子宫肌瘤组织中的成纤维细胞，观察其活化水平；采用雌激素刺激，比较刺激前后成纤维细胞活化、增殖活力的改变及细胞增殖通路信号分子的表达情况，同时采用RNAi干扰技术抑制FAP基因表达，观察雌激素对FAP基因抑制后TAF的活化效应。通过多种生物学技术方法，探索雌激素对子宫基质成纤维细胞的活化作用及FAP表达在雌激素对肌瘤基质成纤维细胞的活化和促增殖中的作用。

1材料与方法

1.1材料

选择因子宫肌瘤需行子宫切除术患者10例，排除子宫肉瘤、多囊卵巢综合征等妇科肿瘤及内分泌疾病，术前6个月无使用激素类药物治疗史，术后病理证实为子宫肌瘤。取患者子宫肌瘤和子宫平滑肌组织各5g。

1.2原代细胞分离及培养

取子宫平滑肌和子宫肌瘤组织(各约2g)分别置于加双抗(青霉素：1 000IU/mL，链霉素：1 000μg/mL)的汉克斯平衡盐溶液(Hanks balanced salt solution，HBSS)里转移至实验室；取适量平滑肌和肌瘤组织(各约2g)分别进行下述处理：用眼科剪剪碎后加0.4%混合胶原酶8～10mL(含20μg/mL DNaseⅠ)、0.05%胰酶2mL，37℃摇床消化2～3h，过单细胞滤网(30μm)，去除死细胞(Dead Cell Removal Kit，#130-090-101)，细胞计数；离心(300g)10min，弃上清液，重悬每107细胞于80μL缓冲液；每107细胞加20μL结合抗成纤维细胞抗体的磁珠(#130-050-601)，室温孵育30min；每107细胞加1～2mL缓冲液清洗，离心(300g)10min，弃上清液；重悬最多108细胞于500μL缓冲液，置于分选器磁场中的分选柱，收集未标记的细胞，将柱子转移至收集试管，洗出标记的成纤维细胞。

1.3Western blot检测

细胞收集后采用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解，4℃下离心(12 000g)15min，抽提蛋白，采用蛋白定量分析试剂盒(BCA)定量，储存于-80℃。蛋白经沸水煮5min，每孔加20μg蛋白，进行凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，加入含3%牛血清白蛋白(BSA)的等渗盐溶液(TBST)溶液室温封闭60min，加入相应一抗室温孵育2h，洗涤后加入二抗室温封闭1h，增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)法进行发光，采用ImageQuant LAS4000测定条带测灰度值。

1.4细胞免疫荧光

细胞采用4%多聚福尔马林室温固定15min，磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，加入封闭液(PBS，3% BSA，0.1% Triton-X 100)室温封闭30min。加入一抗抗FAP抗体(1:200，ab28244，Abcam)/ ER-α抗体(1:100，ab9269，Abcam)，置湿盒内，4℃过夜，细胞经PBS洗涤后加入二抗(Alexa Fluor标记山羊抗兔抗体及FITC标记山羊抗鼠抗体)室温孵育1h，PBS洗涤10min，荧光共聚焦显微镜观察拍照。

1.5实时定量-聚合酶链式反应(RT-PCR)

采用SYBR Green I 荧光定量PCR检测ER-α和ER-β的基因表达水平。采用Trizol从冰冻的组织中提取总RNA，采用逆转录酶合成cDNA，ER-α上游引物：5′-TCCT￣GCCAGCTCATTTCCTTC-3′，反向引物：5′-TCACCTGGGTC￣ATTGGCTAAC-3′，ER-β上游引物：5′-GACA￣TGCTC￣CTGGCAACTAC-3′，反向引物：5′-ATGCCGCTCTTGGCAATC-3′，GAPDH 作为参照基因，上游引物:5′-GCACCGTC￣AAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-GCCTTCT￣CCATGGTGG￣TGAA-3′。将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下：50℃下变性2min，95℃下变性5min，95℃下变性15s和60℃下变性35s，循环40次。

1.6 MTT比色法检测

成纤维细胞，正常平滑肌细胞(SMC)及肌瘤细胞(UFC)按5 000个/孔接种于96孔板，分别在24h、48h及72h时间节点进行MTT检测。每组每孔加入20μL MTT溶液(0.5mg/mL)，继续培养4h后弃去孔内培养液，每孔再加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，计算增长速率。

1.7 RNA干扰

成熟的反义序列是5′-TTCTAGGATATTGTTCATCGC-3′，用慢病毒(载体或包含FAP shRNA的载体)感染成纤维细胞48h后，再分别培养48h、72h，检测细胞的增殖活力、ECM(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)、生长因子(TGF-β、IGF-1)及细胞增殖通路相关信号分子的表达。

1.8统计学方法

采用SPSS 16.0软件，组间分析采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1子宫肌瘤组织存在活化的成纤维细胞

Western blot检测结果显示CD90在TAF及成纤维细胞中表达较高，而在子宫肌瘤及周围平滑肌组织中分离的平滑肌细胞中表达低，表明免疫磁珠法可分离得到纯度高的成纤维细胞，可用于后续的研究，见图1A。细胞免疫荧光及Western blot检测结果均显示，FAP在TAF中的表达强于成纤维细胞，表明TAF处于活化状态(n=10，P<0.05)，见图1B、图1C。

注：A.采用结合有抗CD90的免疫磁珠分选成纤维细胞(10例)，并采用抗CD90抗体检验分离纯度；B.western blot法检测子宫平滑肌和肌瘤组织来源成纤维细胞FAP的表达水平；C.细胞免疫荧光法检测子宫平滑肌和肌瘤组织来源成纤维细胞FAP的表达水平。

图1 子宫肌瘤组织来源成纤维细胞处于活化状态

Fig.1 Fibroblasts in activation state in uterine fibroid

2.2子宫肌瘤组织中活化成纤维细胞的雌激素受体表达增加

细胞免疫荧光、western-blot和PCR法检测结果显示，正常平滑肌组织成纤维细胞和子宫肌瘤TAF均表达ER-α和ER-β，且TAF ER-α、ER-β的表达高于平滑肌组织来源成纤维细胞)，表明雌激素能作用于子宫肌瘤TAF及平滑肌组织来源成纤维细胞(n=10，P<0.05)，见图2。

注：A.子宫肌瘤TAF及平滑肌组织来源成纤维细胞ER-α、ER-β的表达水平;B.Western blot检测子宫肌瘤TAF及平滑肌组织来源成纤维细胞的雌激素受体表达水平。C.细胞免疫荧光检测子宫肌瘤TAF及平滑肌组织来源成纤维细胞的ER-α、ER-β表达水平。

图2 两种组织来源成纤维细胞雌激素受体的表达

Fig.2 Expressions of estrogen receptors in fibroblasts from two kinds of tissues

2.3雌激素促进成纤维细胞的增殖

选择雌激素作用的两个有效浓度(10ng/mL、50ng/mL)，外加雌激素至培养的成纤维细胞及TAF，采用MTT法检测成纤维细胞及TAF的增殖能力，实验结果显示：经雌激素刺激48h、72h后，成纤维细胞及TAF的增殖活力显著增强(n=5，P<0.05)，见图3。表明，雌激素能增强成纤维细胞及TAF的增殖活力。

注：A.成纤维细胞的增殖活力；B.TAF的增殖活力。

图3 雌激素能增强成纤维细胞的增殖活力

Fig. 3 Effect of estrogen on proliferation of Fib and TAF cell.

2.4雌激素能激活成纤维细胞增殖信号通路、促进生长因子及ECM的分泌

Western blot检测了雌激素刺激成纤维细胞后，细胞增殖信号通路相关分子表达的改变。结果显示雌激素能促进成纤维细胞及TAF细胞的增殖信号通路分子MEK、ERK1/2及AKT的磷酸化水平，且在50nM浓度的作用较为显著，见图4。ELISA法检测雌激素分别刺激成纤维细胞及TAF后，TAF及成纤维细胞的TGF-β、IGF-1的分泌量均显著增加(n=5，P<0.05)，见图5A、图5B。western-blot检测显示在雌激素的作用下，成纤维细胞及TAF的FAP、ECM，如CollgenⅠ，Fibronectin、Laminin表达强度高(n=5，P<0.05)，见图5C、图5D，上述结果提示雌激素能刺激成纤维细胞活化，释放生长因子并促进ECM的表达。

图4 雌激素能激活成纤维细胞增殖信号通路

Fig.4 Effect of estrogen on activating cell proliferation pathway

注：A.成纤维细胞及TAF的TGF-β的表达水平。B.成纤维细胞及TAF的IGF-1表达水平；C.成纤维细胞及TAF的Collagen1表达水平；D.成纤维细胞及TAF的FAP、Fibronectin及Laminin表达水平。

图5 雌激素能促进成纤维细胞分泌生长因子及ECM成分

Fig.5 Effect of estrogen on promoting secretion of growth factor and ECM in fibroblast

2.5沉默FAP的表达能抑制Fib活化及细胞增殖通路

采用RNAi的方法，抑制FAP的表达，在此基础上用雌激素对成纤维细胞进行刺激，结果显示，成纤维细胞在FAP抑制后，细胞的增殖活性下降，活化水平不如非抑制状态下显著，但未完全阻断，因此结果提示雌激素是部分通过FAP途径来活化成纤维细胞的，见图6A。且FAP经抑制表达后，细胞增殖信号通路分子的磷酸化部分下降，表明FAP在细胞增殖信号通路活化中的促进作用，见图6B。成纤维细胞ECM成分(Fibronectin、Laminin、Collgen Ⅰ)的表达水平亦下降，表明FAP也影响雌激素介导的ECM活化通路(n=5，P<0.05)，见图6C。

注：A.TAF的增殖活力;B.细胞增殖通路信号分子AKT, MEK, ERK1/2及c-FOS的磷酸化水平;C. TAF的Fibronectin及Laminin的表达水平。

图6 沉默FAP基因表达能抑制成纤维细胞活化及其细胞增殖通路

Fig.6 Effect of silencing FAP gene on prohibiting fibroblast activation and its proliferation pathway

3讨论

3.1成纤维细胞活化蛋白表达对雌激素调控的影响

FAP属于丝氨酸蛋白酶家族，能通过降解ECM、抑制免疫系统的抗肿瘤反应及激活细胞信号通路，促进肿瘤的生长。但目前为止，FAP在子宫肌瘤中的调控尚未见有相关研究。雌激素在子宫肌瘤的发病过程中具有重要作用；多种生长因子，如vEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1、EFG也被证实参与了子宫肌瘤的发病。近来有研究表明，肌瘤细胞、成纤维细胞及其之间的信号转导可能也参与了子宫肌瘤的发病过程[7]。然而到目前为止，关于子宫肌瘤基质成纤维细胞的活化情况、活化因素及活化的成纤维细胞的生物学功能尚缺乏研究。本课题对子宫肌瘤与正常平滑肌组织中成纤维细胞纯化分离并进行研究，检测了子宫肌瘤组织来源成纤维细胞的活化水平并验证了其生物学活性，同时探索了FAP表达对雌激素调控子宫正常平滑肌组织与肌瘤组织成纤维细胞增殖效应的影响。

3.2成纤维细胞的活化程度显著高正常子宫平滑肌组织

TAF主要来自组织中成纤维细胞的活化，TAF的标记蛋白包括α-SMA、FAP、成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast specific protein 1，FSP1)等[8]。FAP特异表达于组织损伤愈合过程及90%以上的上皮恶性肿瘤的基质成纤维细胞中，包括结肠癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌，在正常组织成纤维细胞中通常不表达，可作为一个确定的成纤维细胞激活表型的标记物[9]。本文研究发现，TAF FAP的表达水平明显高于成纤维细胞。结果表明，子宫肌瘤组织中成纤维细胞的活化程度显著高正常子宫平滑肌组织。

鉴于活化的成纤维细胞在肿瘤发病过程中的重要作用及雌激素在子宫肌瘤发病机制中的作用，进一步验证了雌激素对成纤维细胞的活化作用。众所周知，雌激素主要通过ER介导发挥生物学效应。到目前为止，尚未有关于子宫肌瘤基质成纤维细胞ER的表达情况的研究。本课题通过免疫磁珠法分别分离出子宫正常平滑肌组织和子宫肌瘤组织中的成纤维细胞，并检测ER的表达，结果发现，TAF及Fib均表达雌激素受体(ER-α、ER-β)，且在TAF上的表达水平明显高于Fib，提示TAF较Fib对雌激素刺激可能具有更高的敏感性。然而，经过雌激素刺激，肌瘤与平滑肌组织来源成纤维细胞究竟会有什么样的生物学行为改变，及其可能在子宫肌瘤生发过程中的作用，目前也未见有文献报道。为此，本研究采用雌激素刺激TAF及Fib，结果发现，经雌激素刺激后，TAF及Fib的增殖活力较刺激前增强；FAP、ECM成分(Collagen I、Fibronectin、Laminin)、生长因子(TGF-β、IGF-1)的表达水平均发生显著上调，且表现为浓度依赖性；此外，两种组织来源成纤维细胞的增殖通路信号分子(p-AKT，p-MEK，p-ERK及p-c-Fos)的磷酸化水平也上调；提示雌激素能活化两种组织来源的成纤维细胞，并促进其分泌ECM成分、细胞因子及增殖活力的增强。

3.3成纤维细胞活化蛋白参与了肿瘤生长的调控

FAP不仅是成纤维细胞活化后特异表达的标记物，研究表明，FAP还参与了肿瘤生长的调控。FAP属于丝氨酸蛋白酶家族，能降解脯氨酸与其他氨基酸之间的肽键，同时FAP还具有内肽酶活性使其具有降解明胶、I型胶原蛋白的能力，重塑ECM，促进细胞的侵袭能力[10]，FAP阳性细胞具有免疫抑制能力，能够抑制免疫系统的抗肿瘤反应[11-12]，此外，有研究还表明，除了酶活性外FAP还具有激活细胞信号通路的能力，也能促进肿瘤的生长[13-14]。但目前为止，FAP在子宫肌瘤中的调控尚未见有研究。本课题采用RNAi特异沉默TAF中FAP基因的表达，进一步观察抑制FAP表达对成纤维细胞活化及增殖调控相关事件的影响。结果发现，TAF的FAP被抑制后，雌激素介导的促TAF分泌 ECM成分、生长因子(TGF-β、IGF-1)及增强TAF的增殖活力的作用被抑制，细胞增殖通路上的相关信号分子(AKT、ERK、c-Fos、 MEK)的磷酸化水平也显著降低。以上结果表明，FAP在雌激素促成纤维细胞活化的过程中具有重要作用。

本课题对子宫肌瘤成纤维细胞进行了独立研究，证明成纤维细胞在子宫肌瘤中处于活化状态，雌激素能活化成纤维细胞，活化的成纤维细胞能够分泌TGF-β，通过自分泌和(或)旁分泌途径，放大活化效应，介导成纤维细胞增殖效应，而沉默FAP基因表达后则能抑制活化的成纤维细胞的上述生物学作用。本课题结果提示：基质成纤维细胞活化在子宫肌瘤发病中具有重要作用；FAP在成纤维细胞促细胞增殖效应中具有关键作用，可能成为今后的治疗靶点。

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[专业责任编辑：吕淑兰]

Inhibiting estrogen-mediated cell proliferation effect by silencing the expression of fibroblast cell FAP gene

LUO Ning1, YANG Juan-juan2, GUO Jing1, CHEN Li1, CHENG Zhong-ping1

(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Yangpu Hospital Affiliated to Tongji University,Minimally Invasive Gynecology Lab, Medical College of Tongji University, Shanghai 200090, China;2.The First People’s Hospital of Wujiang District, Jiangsu Suzhou 215200, China)

Objective To explore the effect of fibroblast activation protein (FAP) expression on the estrogen-mediated activation and proliferation of uterine leiomyoma fibroblast cell. Methods Fibroblast cells from uterine smooth muscle (fib) and uterine leiomyoma or tumor associated fibroblast (TAF) were separated using immunomagnetic beads, and the expression of estrogen receptor (ER-α/ER-β) was measured. Normal uterine smooth muscle fibroblast and uterine lieomyoma fibroblast or tumor associated fibroblast (TAF) were stimulated with estrogen, and the changes of FAP, extracellular matrix (ECM), growth factor secretion, cell proliferation activity and signal molecular of cell proliferation pathway were measured. The expression of FAP gene in TAF was silenced by RNA interference and the influence of estrogen on expressions of the above TAF markers was analyzed. Results The expression levels of FAP and ER-α/ER-β in TAF were higher than those in fibroblast (n=10,P<0.05). After E2stimulation, the expressions of FAP, ECM(Fibronectin, Laminin, Collgen I)and growth factor(TGF-β, IGF-1), proliferation activity and phosphorylation level of signal molecular of cell proliferation pathway(AKT, ERK, c-Fos, MEK)increased . Silencing FAP expression with RNA interference could inhibit the E2-mediated biological effects. Conclusion FAP expression is the key to the E2-mediated activation and proliferation of fibroblast cells, which hints that FAP may play an important role in the pathogenesis of uterine leiomyoma, and can be targeted in future for the treatment of uterine leiomyoma.

uterine fibroid; fibroblast; tumor association fibroblast (TAF); estrogen; fibroblast activation protein (FAP)

2015-05-25

罗 宁(1986-)，男，住院医师，硕士研究生，主要从事妇科微创技术、子宫肌瘤的研究。

程忠平，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.015

R737.33

A

1673-5293(2016)10-1210-05