头穴透刺对脑梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影响研究

桑鹏　王顺　赵佳辉

头穴透刺对脑梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影响研究

桑鹏王顺赵佳辉

目的 观察头穴透刺对脑梗死大鼠ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β的影响。方法 线栓法造模；行头穴透刺，一般针刺，药物注射治疗；2个疗程后检测ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β。结果 头穴透刺组明显提升大鼠PDGFR-β表达和降低ET、IP3、Mg2+的含量，与一般针刺组、药物治疗组对比差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 头穴透刺通过对ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β调节发挥脑保护作用。

脑梗死；头穴透刺；ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β

1　研究方法

1.1实验方法

1.1.1实验分组 150只大鼠随机分为头穴透刺组，一般针刺组，药物注射组。

1.1.2模型复制 线栓法复制大鼠大脑中动脉梗死的模型[1]。

1.1.3模型成功标志 大鼠同一边的Horner征及大鼠另一边以前肢为主的偏瘫。

1.2模型评估

0分：未能发现大鼠神经损伤的症状；1分：大鼠对侧前爪完全伸直受限；2分：大鼠只能向对侧转圈；3分：大鼠会向对侧倾倒；4分：大鼠意识丧失及无法自主活动。

1.3治疗

1.3.1针刺器材 贵州安迪药械有限公司毫针，直径0.35 mm，长13 mm。

1.3.2选穴 《实验针灸学》动物穴位。

1.3.3治疗刺激参数 使用频率为50 Hz及波宽度为0.3 ms的连续波，刺激到大鼠有明显肌肉收缩为有效刺激度。

1.3.4治疗方法 头穴透刺组选穴：百会透双侧曲鬓，前神聪透向双侧悬厘；患侧上肢的曲池、手三里、外关、合谷及患侧下肢阳陵泉、丰隆、足三里、三阴交。得气后上述穴位选用G-6805型电针仪给予适当刺激。每日刺激1次，7 d为1个疗程，共治疗2个疗程。一般针刺组选穴：患侧上肢的曲池、手三里、外关、合谷及患侧下肢阳陵泉、丰隆、足三里、三阴交；得气后上述穴位选用G-6805型电针仪给予适当刺激。每日刺激1次，7 d为1个疗程，共治疗2个疗程。上述电针仪均为青岛鑫升实业有限公司准字2000第2270088号电针仪。药物注射组：脑蛋白水解物注射液（曲奥）30 ml（三联药业有限公司，国药H20051202），每日注射1次，7 d为1个疗程，共治疗2个疗程。

1.4取材

4%多聚甲醛快速灌注，灌注固定完成迅速断头。取出脑干及脊髓，放入已标记好的Eppendorf管内，液氮暂保存，-80℃冰箱保存待测。

2　试验研究

2.1IP3和ET，Mg2+的检测

第一步取出标好编号的标板，依据实验操作要求分别加入100 μl的标准品于空白微孔中；第二步分别取三组治疗前、1个疗程后、2个疗程后实验大鼠的血清，加入100 μl血清于空白微孔中；标准品孔中和样品孔中加入50 μl的酶标记溶液，使用搅拌器让液体混合均匀。标本加满洗涤应用液后20～30 s轻摇标本静置，间隔20～30 s重复前操作，如此室温下往复操作3 min。所有孔中加入底物A 50 μl和 B 50 μl；每次添加液体后都需要使用辅助器械让液体混合均匀，然后在37℃水浴锅中避光反应15 min；每个微孔中加入50 μl的终止液，混匀液体；在TECAMGENIOS酶标仪的450 nm处测定OD；根据制备的标准曲线，计算样本含量。

2.2PDGFR-β检测

本实验使用的染色试剂是辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素。基本步骤：组织进行石蜡切片，将切好并用福尔马林固定的组织切片在常温中静置1 h，进行脱蜡致水化，再用蒸馏水冲洗；3%甲醇-过氧化氢室温孵育8 min左右，用来减少过氧化物酶的活性，pH酸碱度在7.2左右的PBS缓冲剂清洗6 min；使用微波抗原修复，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物在37℃孵育10 min，PBS 洗4 min；DAB显色液显色，用自来水冲洗来终止反应；苏木精再复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。

3　统计学方法

离子含量的数据资料采用SPSS 13.0软件进行处理；实验中的数据均用（均数±标准差）（±s）表示；计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，q检验用于组间、组内分析的处理。

4　结果

头穴透刺组、一般针刺组及药物注射组ET、IP3、Mg2+、PDGFR-β治疗前后对比见表1～4。

表1　血清Mg2+含量在三组治疗前后的比较[（±s），mmol/L]

表1　血清Mg2+含量在三组治疗前后的比较[（±s），mmol/L]

注：头穴透刺组Mg2+含量治疗前后分析△P＜0.01。一般针刺组与药物注射组治疗前后分析▲P＜0.05。治疗2个疗程后头穴透刺组与一般针刺组与药物注射治疗组对比P＜0.01

组别 　治疗前 　1个疗程后 　2个疗程后头穴透刺组 　1 . 3 3 ± 0 . 1 6△　1 . 0 9 ± 0 . 2 7 　0 . 7 4 ± 0 . 1 1△一般针刺组 　1 . 3 4 ± 0 . 1 8▲　1 . 2 6 ± 0 . 2 3 　1 . 1 4 ± 0 . 2 4▲药物注射组 　1 . 3 2 ± 0 . 2 1▲　1 . 2 7 ± 0 . 2 2 　1 . 1 9 ± 0 . 1 4▲

表2　血清IP3含量在三组治疗前后的比较[（±s），mmol/L]

表2　血清IP3含量在三组治疗前后的比较[（±s），mmol/L]

注：头穴透刺组IP3（mmol/L）含量治疗前后分析△P＜0.01。一般针刺组与药物注射组治疗前后分析▲P＜0.05。治疗2个疗程后头穴透刺组与一般针刺组与药物注射治疗组对比P＜0.01

组别 　治疗前 　1个疗程后 　2个疗程后头穴透刺组 　6 . 3 3 ± 0 . 1 6△　4 . 0 9 ± 0 . 2 7 　3 . 8 8 ± 0 . 2 6 9△一般针刺组 　6 . 3 4 ± 0 . 1 8▲　5 . 2 6 ± 0 . 2 3 　4 . 3 8 ± 0 . 2 4 1▲药物注射组 　6 . 3 2 ± 0 . 2 1▲　5 . 2 7 ± 0 . 2 2 　4 . 5 9 ± 0 . 2 7 1▲

表3　血浆ET含量治疗前后的比较[（±s），ng/L]

表3　血浆ET含量治疗前后的比较[（±s），ng/L]

注：头穴透刺组ET（ng/L）含量治疗前后分析△P＜0.01。一般针刺组与药物注射组治疗前后分析▲P＜0.05。治疗2个疗程后头穴透刺组与一般针刺组与药物注射治疗组对比P＜0.01

组别 　治疗前 　1个疗程后 　2个疗程后头穴透刺组 　8 1 . 4 3 ± 1 5 . 6 7△　6 4 . 7 3 ± 1 1 . 4 7 　5 8 . 8 5 ± 4 . 8 3△一般针刺组 　8 2 . 8 5 ± 1 7 . 2 1▲　7 2 . 6 5 ± 2 . 9 3 　7 0 . 7 4 ± 3 . 3 1▲药物注射组 　8 1 . 4 1 ± 1 9 . 4 3▲　7 6 . 8 6 ± 1 7 . 2 4 　7 4 . 8 3 ± 5 . 6 1▲

表4　PDGFR-β阳性细胞计数比较（400倍镜下计数）

5　讨论

PDGFR引起血管收缩，诱导受损上皮细胞与内皮细胞分裂增殖，促进血管的形成再生[2]。试验14 d后，脑梗死大鼠神经元的PDGFR-β特异性免疫染色显著增强，可见到特异免疫着色，阳性细胞数也增加，特异性神经元和反应性胶质细胞密集分布[3]。

脑梗死大鼠ET含量明显增高，主要是ET在脑梗死急性期，因应激反应、内皮细胞受损、缺氧等因素生成与释放增加，促进缺血性脑水肿的发生和发展[4]。ET浓度与神经功能缺损程度评分呈正相关[5]。

IP3是细胞内信号传导的重要途径和第二信使，三磷酸肌醇是IP3与Ca2+信号传递的重要组成部分。因为IP3水溶性，可以与内质网上的内质膜或液泡膜结合，从而打开Ca2+通道阀门，引起钙离子的释放[6]。IP3从质膜运动到胞质溶胶的过程使钙浓度升高；增强细胞膜的活性、降低环磷酸腺苷[7]。

脑梗死模型的大鼠的治疗前后Mg2+与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。急性脑梗死发生后，电解质紊乱，Ca2+流向细胞内，Mg2+的利用率增加，大量流向细胞外；治疗2个疗程后血清Mg2+慢慢恢复正常水平，Mg2+可以防止过多的钙离子进入细胞内，改变血流量、减少GREB蛋白质，预防血小板的聚集，保护损伤的脑神经[8]。

[1]Tamam B，Tasdemir N，Tamam Y. The prevalence of dementia three months after stroke and its risk factors[J]. Turk Psikiyatri Derg，2008，19（1）：46-56．

[2]Serrano S，Domingo J，Rodriguez-Garcia E，et al. Frequency of cognitive impairment without dementia in patients with stroke: a two-year follow-up study[J]. Stroke，2007，38（1）：105-110．

[3]杨续艳，王锐，郭淑颖，等. 电项针疗法对大鼠脑缺血再灌注模型脑组织EPO表达的影响[J]. 针灸临床杂志，2009，25（5）：24-26．

[4]沈君，王和德，尹格平，等. 急性脑梗死患者CD62P与红细胞内外钙离子浓度变化的研究[J]. 河南实用神经疾病杂志，2001，4（2）：4-5.

[5]孙怡，杨任民. 实用中西结合神经病学[M]. 北京：人民卫生出版社，2013：152-155.

[6]朱肖菊，王晓杰. 电项针疗法对脑缺血再灌注大鼠 ICAM-1及ICAM-1mRNA表达的影响[J]. 针灸临床杂志，2011，27（7）：60-62．

[7]霍金，韩数. 电项针干预对老年性痴呆大鼠5-HT及CHATm-RNA的影响[J]. 针灸临床杂志，2012，28（4）：68-70．

[8]刘娇，冯晓东. 电针百会、神庭穴配合康复训练治疗脑卒中后认知障碍临床研究[J]. 中医学报，2013，28（4）：608-610．

Effects of Scalp Acupuncture on ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β in Rats With Cerebral Infarction

SANG Peng WANG Shun ZHAO Jiahui Department of Acupuncture and Moxibustion, Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150001, China

Objective To observe the effect of scalp acupuncture on ET, IP3, Mg2+and PDGFR-β in rats with cerebral infarction. Methods Suture model, head points acupuncture, acupuncture treatment, drug injection, detection of ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β, after 2 courses of treatment. Results the expression of PDGFR-β, ET, IP3and Mg2+were significantly improved in the scalp acupuncture group, and the difference was statistically significant in the acupuncture group and the medicine group (P＜0.01). Conclusion Through the scalp penetration acupuncture through the ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β play a protective role in the brain.

Cerebral infarction, Head hole through thorn, ET, IP3, Mg2+, PDGFR-β

R245

A

1674-9308（2016）30-0184-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.30.121

黑龙江中医药中青年科技攻关项目（ZQG009）

黑龙江省中医药科学院针灸科，黑龙江 哈尔滨 150001

头穴透刺治疗脑梗死临床疗效肯定，以往研究多局限于病例观察，缺乏严格随机对照分组及大样本规范性的观察研究，从而影响神经传导相关的生化实验室检测指标，及动物实验匮乏，无法运用科学思维论证头穴透刺疗法对脑梗死的治疗作用机理。

该实验补充了与神经传导相关的生化离子实验室研究；弥补了动物实验论证等方面的不足；为头穴透刺治疗脑病提供了新的思路。