头穴丛刺对AD大鼠cAMP-PKAc-CREB及胆碱能的影响*

李虹霖,徐 飞,夏昆鹏,张 淼△,王玉珏

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150000)



头穴丛刺对AD大鼠cAMP-PKAc-CREB及胆碱能的影响*

李虹霖1,徐 飞2,夏昆鹏1,张 淼1△,王玉珏1

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;2.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨 150000)

观察头穴丛刺对AD大鼠cAMP、PKAc、CREB及血清Ache、CHAT含量的影响。方法: 采用Aβ1-42双侧海马区注射建立AD大鼠模型，随机将大鼠分为空白组、模型组、头穴丛刺组、传统头针组和体针组。每组各12只，通过westernblot及放免法观察大鼠海马区cAMP、PKAc、p-CREB/CREB的变化，采用固相夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清Ache、CHAT含量。结果：各治疗组与模型组相比cAMP、P-CREB/CREB、PKAc/β-action表达均具有显著性差异(P<0.05)，cAMP水平上：体针组与头穴丛刺组相比具有统计学差异(P<0.05)，头穴丛刺组与传统头针组相比有上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，体针组与传统头针组比较无显著性差异(P>0.05)；在p-CREB/CREB水平上：体针组与头穴丛刺组相比具有显著性差异(P<0.05)，头穴丛刺组与传统头针组相比有上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，体针组与传统头针组比较具有统计学差异(P<0.05)；在PKA/β-actin水平上：传统头针组、体针组与头穴丛刺组相比具有统计学差异(P<0.05)，体针组与传统头针组比较无显著性差异(P>0.05)。头穴丛刺组、传统头穴组、体针组与模型组相比(P<0.05)，Ache、CHAT表达具有统计学差异；Ache水平上：体针组与头穴丛刺组相比(P<0.05)，具有统计学差异，头穴丛刺组与传统头针组相比有下降趋势，但(P>0.05)，两者比较无显著性差异，体针组与传统头针组比较(P>0.05)，两者比较无显著性差异；在CHAT水平上：体针组与头穴丛刺组相比(P<0.05)，具有统计学差异，头穴丛刺组与传统头针组相比(P<0.05)，两者比较有显著性差异，体针组与传统头针组比较(P>0.05)，无统计学差异。结论:头穴丛刺可以提高cAMP、PKAc、p-CREB/CREB水平，明显降低血清中AchE的活性，增强ChAT的活性，进而改善大鼠学习记忆能力。

头穴;丛刺;cAMP;PKAc;CREB；胆碱能

阿尔茨海默病(AD)是一种多发生在老年前期或老年期，以进行性认知功能障碍和行为学损害为主要表现的中枢神经系统退行性改变。笔者既往通过水迷宫实验研究发现，头穴丛刺疗法能够提高AD大鼠的学习记忆能力[1]。本研究在既往研究的基础上进一步观察其对AD大鼠海马区cAMP、PKAc、CREB的影响及血清Ache、CHAT含量，揭示头穴丛刺疗法对于大鼠学习记忆能力调控的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康雄性Wistar大鼠60只，每只250～300 g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供[SCXK( 黑) 2008001]，大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司),试剂淀粉样蛋白片段(Aβ1-42)(美国Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)注射于腹腔，麻醉大鼠。脑立体定位仪固定大鼠头部。头部颅顶区消毒后，将大鼠头部上方皮肤沿中线剪开2 cm，暴露颅骨，在双侧海马区用注射Aβ1-42寡聚体5 μL，注射完毕后清创缝合消毒[2]。

1.2.2 实验分组及干预方法 随机分为5组:空白组、模型组、头穴丛刺组、传统头针组和体针组，每组各12只。

空白组:用等量生理盐水代替Aβ1-42寡聚体注射于大鼠海马区。

头穴丛刺组:造模成功7天后给予治疗，取神庭穴、百会穴、前顶穴及这三穴左、右侧各旁开5 mm处，用0.35 mm×15 mm毫针平刺2 mm，平补平泻手法，捻转1 min留针2 h，每日1次，6天为1个疗程，间隔1天，共治疗4个疗程。

传统头针组:取百会、四神聪，用0.35 mm×15 mm毫针，平刺2 mm，平补平泻手法，捻转1 min后留针15 min。疗程同上。

体针组:取双侧肾俞穴、足三里穴，用0.35 mm×15 mm毫针，肾俞穴稍向内斜刺5 mm，足三里穴直刺10 mm，平补平泻手法捻转1 min后留针15 min。疗程同上。

1.2.3 Western Blot印迹分析 取大鼠双侧海马组织，剪碎，裂解，离心，取上清，测定蛋白含量，电泳分析，转膜，免疫反应，显色。对蛋白带进行灰度分析，以β-actin作为内对照，测得PKAc蛋白的半定量指标及p-CREB/CREB相对比值。

1.2.4 放免法检测海马组织cAMP含量 将分离出的海马组织，放入匀浆器中充分匀浆。加入2 ml无水乙醇冲洗匀浆器与匀浆液合并，混匀，静置5 min后，3 500转/min离心15 min后，取上清液，60℃烘箱中烘干，4℃保存，测得cAMP含量。

1.2.5 血清Ache、CHAT含量检测 采用固相夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA法)进行测定血清Ache、CHAT含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行分析，实验数据采用均数±标准差表示，组间数据比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1示，各治疗组与模型组相比cAMP、P-CREB/CREB、PKAc/β-action表达均具有显著性差异(P<0.05)，cAMP水平上：体针组与头穴丛刺组相比具有统计学差异(P<0.05)，头穴丛刺组与传统头针组相比有上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，体针组与传统头针组比较无显著性差异(P>0.05)；在p-CREB/CREB水平上：体针组与头穴丛刺组相比具有显著性差异(P<0.05)，头穴丛刺组与传统头针组相比有上升趋势，但无显著性差异(P>0.05)，体针组与传统头针组比较具有统计学差异(P<0.05)；在PKAC/β-actin水平上：传统头针组、体针组与头穴丛刺组相比具有统计学差异(P<0.05)，体针组与传统头针组比较无显著性差异(P>0.05)。

表2示，头穴丛刺组、传统头穴组、体针组与模型组相比(P<0.05)，Ache、CHAT表达具有统计学差异；Ache水平上：体针组与头穴丛刺组相比(P<0.05)，具有统计学差异，头穴丛刺组与传统头针组相比有下降趋势，但(P>0.05)，两者比较无显著性差异，体针组与传统头针组比较(P>0.05)，两者比较无显著性差异；在CHAT水平上：体针组与头穴丛刺组相比(P<0.05)，具有统计学差异，头穴丛刺组与传统头针组相比(P<0.05)，两者比较有显著性差异，体针组与传统头针组比较(P>0.05)，无统计学差异。

表1 各组鼠脑组织中cAMP、p-CREB/CREB、PKAc/β-actin相对表达含量变化

注：与模型组比较,#P<0.05;与头穴丛刺组比较，▲P<0.05;★P>0.05;与传统头针组比较,▼P<0.05，※P>0.05

表2 各组鼠脑组织中Ache、CHAT表达

注：与模型组比较，#P<0.05；与头穴丛刺组比较,▲P<0.05;★P>0.05，与传统头针组比较,※P>0.05

3 讨论

研究表明, cAMP-PKA-CREB信号通路与学习记忆能力相关。cAMP作为细胞内传递信息的第二信使，其含量的增加，可以促进突触前递质的释放，将其注入感觉神经元，可产生5-HT效应，促使短时程的易化效应，PKA是cAMP最主要的效应分子，PKA的抑制剂能阻止其易化[3]。cAMP可以促进与长期记忆相关蛋白的合成，可加速即早基因表达[4]。研究证实，PKA参与LTP的形成。[5]。CREB的下游效应与记忆的形成有关，作为核内的“第三信使”, 推断是对外部刺激产生长时程记忆的最适核转录因子[6-7]，在长期记忆形成过程中起到重要的作用。研究表明，将CREB的反义寡核苷酸注入海马组织时，导致其空间学习能力下降，而阻滞双侧穹窿海马伞的大鼠，也可因海马pCREB的水平下降而使其逃避性记忆能力损害[8]。磷酸化的CREB可影响神经元的存活、生长及突触的可塑性，其活性与数量的变化能影响长时程记忆的表达，形成长时程记忆[9-10]。因此通过干预cAMP-PKA-CREB信号通路能影响AD大鼠的学习记忆能力。乙酰胆碱(Ach)是中枢胆碱能系统与学习记忆功能密切相关的特异神经递质，ChAT是胆碱能神经元的特殊标志，亦是催化Ach生物合成的限速酶[11]。大量研究证明，AD患者乙酰胆碱合成减少，胆碱乙酰转移酶的活性下降，与AD的严重程度密切相关[12]。通过本课题的研究发现头穴丛刺能够激活cAMP，催化PKAc的释放，强化CREB的表达，明显降低AchE的活性，增强ChAT的活性，从而改善大鼠学习记忆能力，疗效显著。

[1] 李虹霖,孙兴华,李默,等.头穴丛刺对老年性痴呆大鼠学习记忆能力的影响[J].针灸临床杂志,2015,31(10):74-76

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Effect of Cluster Needling of Scalp Point Therapy on cAMP-PKAc-CREB and Cholinergic System of Alzheimer’s Disease Rats

LI Hong-lin1,XU Fei2,XIA Kun-peng1,ZHANG Miao1△，WANG Yu-jue1

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150001，China; 2.HeilongjiangProvincialHospital，Harbin150000，China)

Objective：To explore the effect of cluster needling of scalp point therapy on cAMP-PKAc-CREB of Alzheimer’s disease rats. Methods：Establish models with Alzheimer’s disease by injecting Aβ1-42oligomer into bilateral hippocampus.Sixty rats were randomized into five groups including blank control group,cluster needling of scalp point group,traditional head acupuncture group,body acupuncture group and model group.Observe the changes of cAMP,PKAc and p-CREB/CREB through western blot and radio-immunity method，and ELISA method was used to determine Ache,CHAT in blood.Results：It showed marked differences between each treatment group and the model group (P<0.05).As to the cAMP level:there was a statistical difference between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group(P<0.05);it showed a rising trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncture group,but no marked differences between two groups (P>0.05).As to the p-CREB/CREB level:it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed a rising trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncturegroup,but no marked differences between two groups(P>0.05);there was a statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P<0.05).As to the pkac/β-actin level:there were statistical differences among traditional head acupuncture group,body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);there were no marked differences between traditional head acupuncture group and body acupuncture group (P>0.05).As to the Ache：it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed a decreasing trend compared with cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncturegroup,but no marked differences between two groups (P>0.05);there was no statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P>0.05).As to the CHAT：it showed marked differences between body acupuncture group and cluster needling of scalp point group (P<0.05);it showed marked differences between cluster needling of scalp point group and traditional head acupuncture group (P<0.05);there was no statistical difference between body acupuncture group and traditional head acupuncture group(P>0.05).Conclusion：The cluster needling of scalp point therapy can improve learning and memory function of Alzheimer’s disease rats by improving the levels of cAMP,PKAc and p-CREB/CREB，decreasing Ache activity and increasing CHAT activity.

Scalp point;Cluster needling;cAMP;PKAc;CREB；Cholinergic system

黑龙江省自然科学基金编号：H201476;黑龙江省博士后流动站资助基金，编号：LBH-Z14199。

李虹霖(1981-),女，副主任医师，中西医结合专业在站博士后，研究方向：针灸康复治疗神经系统疾病。

△通讯作者：张淼(1973-),女，主任医师，副教授，硕士研究生导师，研究方向：针刺防治老年性疾病的基础临床研究。

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2016-03-31