广泛耐药鲍曼不动杆菌ST238克隆株毒力及适应性特征

何小庆， 　尹　珍， 　杨均均， 　李佳俊， 　陈　力， 　黄文祥

·论著·

广泛耐药鲍曼不动杆菌ST238克隆株毒力及适应性特征

何小庆， 尹珍， 杨均均， 李佳俊， 陈力， 黄文祥

目的 通过检测广泛耐药鲍曼不动杆菌流行克隆ST238的毒力和环境适应性，探讨该克隆株在当地持续流行的机制。方法 比较ST238克隆株与鲍曼不动杆菌ATCC 19606的体外生长曲线及竞争指数（competition index，CI），试管法测定菌株内明胶酶活性；微量法进行D -甘露糖抵抗红细胞凝集试验；运动平板法测定蹭行运动能力；结晶紫染色法定量分析生物膜形成能力。小鼠动物模型检测体内致病力。结果 ST238克隆株与标准株间体外生长能力差异无统计学意义（P＞0.05）。培养24 h时ST238克隆株与鲍曼不动杆菌ATCC 19606在体外竞争能力无明显差异（CI = 0.29，P＞0.05）。明胶酶活性在ST238克隆株与敏感株间分布无差异（P＞0.05）。血凝结果与菌株来源之间差异无统计学意义（P＞0.05）。敏感株的运动能力及生物膜形成能力均强于ST238克隆株（P＜0.05）。ST238克隆株与标准株的LD50分别为6.9和6.7 log CFU/ mL。接种9.3 log CFU/mL菌液的小鼠平均死亡时间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 ST238克隆株获得广泛耐药性后，其环境适应性无明显下降，同时该克隆株的毒力也无明显改变。这种生物学特性可能是该克隆株在当地长期流行的原因之一。

广泛耐药； 鲍曼不动杆菌； ST238克隆株； 适应性； 毒力

重庆医科大学附属第一医院2004―2013年细菌监测数据显示，鲍曼不动杆菌在我院的临床分离率呈逐年上升趋势。至2009年鲍曼不动杆菌占当年细菌感染的17.9 %，成为不发酵糖革兰阴性杆菌第1位致病菌。2010年鲍曼不动杆菌在革兰阴性菌中比例达24.6 %，超过大肠埃希菌，成为医院感染第1位致病菌。流行病学研究证实我院存在广泛耐药（XDR）鲍曼不动杆菌A、B、C 3个克隆的流行。多位点序列分型（MLST）分析发现，B克隆与C克隆均为ST238型，而A克隆与其相比仅有一个管家基因（gpi）的差异，也属于ST238型。ST238克隆株与全球流行的CC92群有较高同源性，但与中国报道的主要克隆株ST22、ST381、ST208和ST92不同。各个国家和地区均未见有关ST238克隆株暴发流行的报道，仅巴西曾在PubMLST注册过1株ST238克隆株，但没有相关文献。我院流行的ST238克隆株仅对多黏菌素和替加环素敏感。为了寻找该克隆在我院长期流行的原因，探讨其流行性与致病性的相关性，为进一步控制鲍曼不动杆菌所致的医院感染提供指导，本课题拟对我院XDR鲍曼不动杆菌ST238克隆株的毒力及生存适应能力进行研究。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源及鉴定 收集2009年1月至2013年12月我院临床分离的鲍曼不动杆菌，每年随机抽取60株，共300株，剔除同一患者相同部位的重复菌株。采用VITEK 2-compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定并保存，剔除其中失活及污染的标本，分离出277株保存完好的鲍曼不动杆菌。采用琼脂稀释法对临床分离的277株鲍曼不动杆菌进行药敏试验，并对筛选出的157株XDR菌株用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行同源性分析，分别成功分离出XDR鲍曼不动杆菌 A、B、C克隆47株、32株、19株。选取分离出的98株仅对多黏菌素和替加环素敏感的XDR鲍曼不动杆菌ST238克隆株作为实验菌株，同时随机选取21株敏感菌株作为毒力对比菌株。质控菌株：鲍曼不动杆菌ATCC 19606为俞云松教授馈赠，铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922为本实验室保存。

1.1.3实验动物 小白鼠为体质量18～22 g的SPF级雌性昆明系小白鼠，购于重庆医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（渝）2007—0001，常规饲养。

1.2方法

1.2.1体外生长曲线测定[1]调整菌液浓度至108CFU/mL，取20 μL菌液加入96孔微量板中，接种14个时间点，每一时间点各做3个重复孔，另外每一时间点均做3孔不加细菌只含有生理盐水的空白对照，补入MH肉汤180 μL，使细菌终浓度为107CFU/mL。将96孔微量板置于37 ℃恒温箱中培养。于每一时间点将MTT（5 mg/ mL）20 μL加至待检测的96孔微量板中，然后每孔加入DMSO 100 μL，震荡10 min，于570 nm处测定吸光度（D）值。

1.2.2体外竞争试验[2]调节菌液浓度为106CFU/ mL，各取100 μL ST238克隆株、ATCC 19606以及上述两者的等量混合菌液接种于MH肉汤2 mL中，37 ℃静置培养。再于2 h、 4 h、8 h、16 h、24 h 5个时间点从各培养液取100 μL，经1∶105稀释，稀释液分别用含有亚胺培南（8 mg/ L）的固体培养基和空白固体培养基进行细菌计数，37 ℃培养18 h后观察结果。

1.2.3明胶酶活性检测[3]挑取单个复活菌落穿刺接种于含120 g/L明胶的LB培养液高层中，37 ℃孵育，每间隔24 h放置于4 ℃冷却1 h后倒置试管，观察是否出现液体流动，至15 d为终点。铜绿假单胞菌ATCC 27853为阳性对照，大肠埃希菌ATCC 25922为阴性对照，LB明胶培养基作为空白对照。

1.2.4D -甘露糖抵抗红细胞凝集试验[4]无菌 PBS缓冲液制备新鲜菌悬液（起始浓度为1010CFU/mL）及1 %新鲜人O型、AB型红细胞悬液（加入含或不含1 % D -甘露糖各1份）。将菌悬液于96孔U型微量板中系列倍比稀释为50 μL/孔，然后再分别于每一系列孔中加入含或不含1 %甘露糖的O型或AB型1 %红细胞悬液各50 μL，震荡混匀后置4℃孵育2 h后观察各孔是否发生红细胞凝集。红细胞聚集成小圆点为阴性，红细胞遍布整个孔底为阳性。PBS 50 μL加入红细胞悬液50 μL作为阴性对照，大肠埃希菌ATCC 25922为阳性对照。

1.2.5蹭行运动能力测定[5]用无菌枪头挑取单个复活菌落穿刺接种于厚约3 mm的LB培养基与培养皿接触面，37 ℃孵育24 h，观察生长菌落周围有无透明菌晕形成，并测量其长径。以3次独立试验菌晕平均直径＞10 mm者为阳性。铜绿假单胞菌ATCC 27853为阳性对照，鲍曼不动杆菌ATCC 19606为阴性对照。

1.2.6生物被膜形成能力定量分析[3]调节菌液浓度为109CFU/mL，取200 μL菌液加入96孔微量板中，200 μL/孔、3孔/株。37 ℃培养36 h，于595 nm处测定D值。PBS 200 μL/孔轻柔清洗3次后晾干，10 %甲醇固定5 min，1 %结晶紫染色15 min，灭菌蒸馏水冲洗至阴性对照无色。室温晾干，200 μL无水乙醇溶解结晶紫30 min，570 nm处读取D值。D570/D595校正各孔D值以排除菌液浓度差异对结果的影响。以3个复孔的校正后D值的平均值作为该株菌的D值，独立重复试验3次。鲍曼不动杆菌ATCC 19606为生物被膜形成阳性对照菌株，含0.25 %葡萄糖的TSB肉汤为阴性对照。生物被膜形成能力判读标准[6]：测定阴性对照（培养液）D值25次，以其平均D + 3S定义为Dc，将待测菌株D与Dc进行比较分为4类：阴性（-）：D≤Dc；弱阳性（1+）： Dc＜D≤2Dc；阳性（2 +）：2Dc＜D≤4Dc；强阳性（3+）：D＞4Dc。

《儿科阿奇霉素注射使用的快速建议指南》实施方案介绍…………………………………………………… 周鹏翔等（4）：436

1.2.7小鼠腹膜炎模型[2,7-8]复苏菌种后增菌，收集细菌，调节菌液浓度为9.3、8.3、7.3、6.3、5.3、4.3 log CFU/mL。将小鼠随机分为13组，每组10只。按每只0.2 mL进行小鼠腹腔注射，对照组注射等量生理盐水。接种后每3 h观察并记录死亡情况，连续观察10 d，绘制存活率曲线，计算LD50。

1.2.8统计方法 采用SPSS17.0进行统计分析，计量资料均以均数+标准差（x±s）表示。重复测量设计的方差分析，判断组间生长能力是否有统计学意义；Fisher确切概率法，比较ST238克隆株与敏感株明胶酶活性、血凝结果阳性率、蹭行运动能力是否有分布差异；Mann-Whitney检验，判断ST238克隆株与对照菌株体外竞争能力、生物被膜形成能力及小鼠平均死亡时间是否有统计学意义；Probit法，计算小鼠LD50。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1体外生长曲线

随机选取10株ST238克隆株及标准株1株。在测定的14 h内，D值随着培养时间的延长而增大，即细菌数随着培养时间延长而增多，组间生长能力差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1　鲍曼不动杆菌生长曲线Figure 1 Growth curve of A. baumannii

2.2体外竞争试验

将ST238克隆株及标准株进行体外竞争试验。培养24 h时，混合生长菌液中的ST238克隆株与标准株的菌液浓度分别为7.04和7.78 log CFU/ mL，ST238克隆株菌液浓度较标准株低0.74 log CFU/mL，但差异无统计学意义（CI=0.29，P＞0.05），见图2。

图2　鲍曼不动杆菌体外竞争曲线Figure 2 In vitro competitive growth curves of A. baumannii

2.3明胶酶活性

仅有1株来源于伤口渗出液的ST238克隆株在观察第2天即出现明确明胶液化现象，余菌株均呈阴性表现，明胶酶活性在组间分布差异无统计学意义（P ＞0.05）。阳性对照菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853于孵育24 h后即表现明显明胶液化能力。

2.4D- 甘露糖抵抗红细胞凝集活性

在无甘露糖存在条件下，O型与AB型人红细胞凝集活性相同，ST238克隆组与敏感组的凝集活性分别为2.0 %和9.5 %，组间阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。在D -甘露糖存在条件下，人O型和AB型红细胞凝集阳性率均升高，ST238克隆组与敏感组分别有15.3 %和19.0 %菌株可使O型红细胞发生凝集，同时有28.6 %和19.0 %菌株可使AB型红细胞发生凝集现象，血凝结果与菌株来源之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　不同组间血凝阳性菌株的分布结果Table 1 The A. baumannii strains positive in hemagglutination assay between groups

2.5蹭行运动能力

98株临床分离的ST238克隆株蹭行运动能力均为阴性，而在随机选取的21株敏感株中蹭行运动阳性率达33.3 %，提示敏感株的运动能力强于ST238克隆株（P＜0.001）。

2.6生物被膜形成能力

25孔阴性对照平均D+3S为0.112 5+3×0.053 4，故在Dc = 0.273水平对菌株生物被膜形成能力进行分析。敏感组生物被膜形成能力强于ST238克隆组（P＜0.05），生物被膜形成能力及分布见表2及图3。

表2　不同组间生物被膜形成能力Table 2 Biofi lm formation ability of A. baumannii in different groups

图3　鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力D值分布Figure 3 Biofi lm formation ability of different A. baumannii strains in terms of D value

2.7LD LD5050结果

将ST238克隆株及标准株进行动物体内实验。2种菌株经腹腔接种均可使小鼠感染致死。ST238克隆株的LD100、LD50和LD0分别为5.0、6.9和9.7 log CFU/mL，而相应的鲍曼不动杆菌ATCC 19606则是4.5、6.7和 9.9 log CFU/mL。接种浓度为9.3 log CFU/mL菌液的小鼠，ST238克隆株及鲍曼不动杆菌ATCC 19606小鼠平均死亡时间分别为（35.7±4.8） h和（34.5±4.74） h，差异无统计学意义（P＞0.05），生存率曲线见图4。对照组小鼠正常生长，活动自如，无一例死亡。

图4　小鼠生存率曲线Figure 4 Survival curves of mice after challenging with A. baumannii strains

3　讨论

近年来，鲍曼不动杆菌由于迅速发展的耐药能力成为世界广泛关注的医院感染病原菌[9]。既往研究一直认为抗菌药物的选择压力及克隆传播可能是ST238克隆株在我院长期存在的主要原因，但近年来我院加强对抗菌药物使用的管理，各类抗生素的使用量（尤其是碳青霉烯类）较2009年均有明显下降，然而我院XDR鲍曼不动杆菌的分离率仍逐年上升，其中以ST238克隆株为主。推测除了抗菌药物的选择作用，可能还存在其他因素导致ST238克隆株在我院长期流行。本研究发现，ST238克隆株与标准株体外生长能力及竞争能力无明显差异，提示广泛耐药性的获得并未导致ST238克隆株体外生存能力的减弱。仅1株ST238克隆株明胶酶检测呈阳性，与SECHI等[10]未检测出阳性菌株的实验结果相似，提示XDR鲍曼不动杆菌 ST238克隆株仍是一种低毒力的病原菌。在有无甘露糖存在条件下，ST238克隆株与敏感株的红细胞凝集能力均无明显差异，然而D -甘露糖的存在可使其红细胞凝集能力增强，提示鲍曼不动杆菌的菌毛多属于甘露糖抵抗型，对细胞的黏附存在甘露糖抵抗现象，这是造成菌株定植的危险因素。蹭行运动由Ⅳ型菌毛介导，是生物被膜形成的一个相关因素，两者间有一定关联，本研究中蹭行运动和生物被膜形成能力结果一致与其相符。既往研究表明，生物被膜作为普遍存在的毒力因子，其形成能力在世界各流行克隆中分布存在差异[11]，其中ST2、ST25、ST78克隆株的形成能力明显强于其他流行克隆[12]。本研究中ST238克隆株生物膜形成能力弱于敏感株，但其他毒力因子未见明显下降，尚不能确定ST238克隆株生物被膜能力是固有形成能力较弱还是与其获得广泛耐药性后致弱有关，需进一步研究证实。ST238克隆组与敏感组的LD50在同一数量级，且接种9.3 log CFU/mL菌液浓度的小鼠平均死亡时间无明显差异，提示ST238克隆株与敏感株的体内致病性差异不大，间接提示ST238克隆株在获得广泛耐药性后并没有导致体内致病能力的减弱。

既往研究表明，耐药性的获得可能导致鲍曼不动杆菌毒力和生存适应能力明显下降[2，7-8]，这可能由于耐药性的获得导致DNA超螺旋结构的稳定性下降，基因突变错配修复系统的失活以及外排泵在排出抗生素的同时可能也排出毒力相关因子如黏附素、毒素、定植及侵袭相关蛋白质等。研究还发现，生存适应能力及毒力的下降程度与细菌获得耐药机制的数量有关，细菌获得的耐药机制越多，其相应的毒力和生存适应能力也下降得越多[13]。这种观点提示耐药菌的产生可能不会给感染的控制带来太大的影响，首先耐药菌由于其毒力和传播能力的下降并不会引起其比例的上升，其次严格控制抗菌药物使用后耐药菌由于失去抗生素选择优势将会逐渐消失。然而，耐药性与毒力的关系仍在研究之中，目前尚没有一个较为肯定的结论。在严格控制抗菌药物使用后ST238克隆株仍能在我院长期流行。本研究发现，ST238克隆株在获得广泛耐药性后，其环境生存适应能力及毒力并无明显下降，这种生物学特性可能与其能在我院长期流行有关。这种现象与最近的研究报道一致，对多黏菌素耐药性的获得并未引起鲍曼不动杆菌适应能力和毒力的下降[14]，不同的耐药机制可能对细菌的环境适应性和毒力有着不同的影响[15]，因此耐药性的获得并不一定都会引起毒力的下降。同时，有研究发现，伤寒沙门杆菌在获得多重耐药突变后失去使小鼠致病能力，然而失去致病能力的耐药菌株很快在没有引起耐药水平改变的情况下出现补偿突变修复了毒力[16]。值得注意的是，有研究报道认为耐药性的获得不一定要以减弱生存适应能力为代价，相反可能会增强病原菌的适应性和毒力，而这可能导致耐药菌的比例在降低抗菌药物使用的情况下仍会持续上升，将给感染的控制带来极大挑战[17-18]。本研究已检测的毒力因子中尚未发现ST238克隆株毒力有增强。然而，该克隆在我院长期流行的过程中可能也存在不断的自我进化，出现一些特殊的毒力基因或者我们未检测到的某些毒力因子毒力增强，这需要进一步研究。

综上所述，我院存在XDR鲍曼不动杆菌ST238克隆株的流行，耐药性的获得并未导致其生存适应能力及毒力的明显下降，这可能是其在我院长期流行的原因之一。同时还不能完全排除其他潜在毒力因子的作用或其他致病机制并存的可能。

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An extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii ST238 isolate without loss of adaptability and virulence

HE Xiaoqing, YIN Zhen, YANG Junjun, LI Jiajun, CHEN Li, HUANG Wenxiang. （Department of Infectious Diseases, the First Affi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）

Objective To study the virulence and environmental adaptability of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii (XDRAB) ST238 clone, and explore the potential mechanisms of the persistent prevalence of this clone. Methods MTT method was employed to examine the in vitro growth of these strains. The competition index (CI) were determined by in vitro competition experiment to compare with A. baumannii ATCC 19606. The gelatinase activity, D-mannose related O/AB hemagglutination activity, twitching motility, and biofi lm formation were studied to analyze its virulence. The median lethal dose (LD50) was determined for mice in sepsis peritoneal infection model. Results The in vitro growth ( P＞0.05 ) or competition experiment (CI = 0.29, P ＞ 0.05) did not show significant difference between ST238 clone and the reference strain ATCC 19606. The gelatinase (P＞ 0.05) and hemagglutination activity (P＞0.05) did not show signifi cant difference between ST238 clone and the susceptible strain. However, the susceptible reference strain ATCC 19606 did show stronger motility and biofi lm formation ability than ST238 clone (P＜0.05). The LD50of ST238 clone and reference strain ATCC 19606 was 6.9 and 6.7 log CFU/mL, respectively. There was no signifi cant difference in the mean time to death of mice after challenging with 9.3 log CFU/mL (P＞0.05). Conclusions A. baumannii ST238 clone acquired extensively drug-resistant ability but without loss of environmental adaptability and virulence. This biological nature may contribute to its persistent prevalence in our hospital.

extensively drug-resistant; Acinetobacter baumannii; ST238 clone; adaptability; virulence

R378

A

1009-7708 ( 2016 ) 06-0779-06

10.16718/j.1009-7708.2016.06.018

重庆市自然科学基金项目（CSTC2008BB5393）；重庆市教育委员会科技项目（KJl00311）。

重庆医科大学附属第一医院感染科，重庆 400016。

何小庆（1990—），女，硕士研究生，主要从事细菌毒力和致病性研究。

黄文祥，E-mail：wenxiang_huang@163.com。

2016-02-17

2016-03-07