黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA表达的影响

2016-11-29李芊绵王超范越田明李芳高士平国紫薇

中医药信息 2016年5期

关键词：五物桂枝黄芪

李芊绵, 王超，范越，田明，李芳，高士平,国紫薇

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA表达的影响

李芊绵, 王超，范越*，田明，李芳，高士平,国紫薇

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

目的：观察黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经组织中生长因子(NGF)和血管内皮因子(VEGF)mRNA表达的影响，初步探讨黄芪桂枝五物汤治疗DPN的机制。方法：采用链脲佐菌素(STZ)诱导制备大鼠糖尿病模型，用黄芪桂枝五物汤连续灌胃8周，分离坐骨神经组织,采用半定量PCR法测定大鼠坐骨神经中NGF mRNA与VEGF mRNA相对表达量。结果：黄芪桂枝五物汤能显著提高NGF mRNA的表达量，降低VEGF mRNA的表达，与模型对照组比较有显著性差异。结论：黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变的保护作用可能与加强NGF mRNA表达，减少代偿性VEGF mRNA表达有关。

黄芪桂枝五物汤；糖尿病周围神经病变；NFG mRNA；VRGF mRNA

糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN)是糖尿病最常见的并发症之一，根据其临床表现，中医将其归为“血痹”“脉痹”范畴[1]。黄芪桂枝五物汤是治疗血痹证的代表方剂，出自《金匮要略》卷上，由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣组成，具有益气通络、和血通痹之效，中医临床常用于治疗DPN[2-4]。现代研究表明，DPN发病机制与生长因子合成和异常代谢途径有关[5-6]。本文通过黄芪桂枝五物汤对大鼠糖尿病模型NGF、VEGF神经因子mRNA表达量的研究，初步探讨黄芪桂枝五物汤治疗DPN的机制。

1 实验材料

1.1 动物

健康SD大鼠100只，雄性，体质量200～250 g(由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供)。

1.2 药物

黄芪桂枝五物汤由黑龙江中医药大学实验中心自制，规格：含生药1 g/ml；甲钴胺片，日本卫才(中国)药物有限公司，0.5 mg/片，批准文号：国药准字H20030812。

1.3 试剂

链脲佐菌素(德国Sigma公司)；M-MLV反转录试剂盒(Takara公司)； DEPC(Sigma公司)；Trizol 试剂盒(Invitrogen公司)；SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒(Takara公司)。

1.4 仪器

普通PCR仪(美国MJ，PTC-100)；凝胶成像系统(美国UVP，GelDoc-It)；酸度计(美国Orion，310P-02)；精密天平(瑞士Mettler-Toledo，AB265-S)；紫外分光光度计(日本岛津，UV-2401)；超纯水仪(美国Millipore，Milli-Q)；荧光定量PCR仪(美国AB，ABI-7500)；低温冰箱(日本SANYO，MDF-382E)；制冰机(美国Grant，XB70)；高速低温离心机(德国Sigma，3-18K)。

2 实验方法

2.1 DPN大鼠模型的制备及分组

取SD大鼠100只，造模前随机选取出15只，作为正常对照组，剩余大鼠腹腔注射STZ 70 mg/kg(由0.1 mol/ml柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制)，72 h后测定血糖变化，血糖≥16.7 mmol/L大鼠归为模型组，编号，分别检测动物坐骨神经传导速度，正常对照组与模型组分笼饲养，自由饮水和进食。10周后，再分别检测模型组动物坐骨神经传导速度，与之前比较，轴突缩小、神经传导速度降低、结周脱髓鞘者归为DPN模型组，共计45只。将45只DPN模型大鼠随机均分为黄芪桂枝五物汤组(HQG)、弥可保组(MKB)、模型组，每组15只。给予灌胃给药：HQG组5 g/(kg·d)；弥可保170 μg/(kg·d)，模型组给予等量蒸馏水。实验过程中大鼠自由饮水和进食，连续灌胃给药8周后，分别处死，分离坐骨神经组织，迅速置于液氮中并保存于-80℃冰箱。

2.2 RNA提取

取坐骨神经组织置于研钵中充分研磨，取100 mg组织中加入Trizol试剂1 ml,室温静置5 min，加入氯仿0.2 ml，充分振荡15 s，并在室温条件下静置3 min。4℃ 12000 rpm离心15 min。取上清，移至新管并加入异丙醇0.5 ml，轻轻混匀，静置10 min后，室温12000 rpm离心10 min后弃上清。向沉淀中加入75%乙醇1 ml ，轻轻混匀。4℃ 7500 rpm离心5 min后弃上清将RNA样品凉干，加入无RNA酶水20 μL溶解。

2.3 cDNA合成

经25 μL 反转录体系:RNA 3 μL，Oligo(dT) 1 μL，dd H2O(DEPC 处理)9.5 μL，以上首先70℃孵育5 min，然后迅速放在冰上。5×Buffer 5 μL，d NTP(10 mmol/L)5 μL，Ribonuclease inhibitor 0. 5 μL，M-MLV RT 1 μL。以上 42℃ 孵育 60 min，然后 70℃ 10 min，将所得的cDNA 保存于-80℃低温冰箱中备用。

2.4 半定量PCR测定NGF mRNA和VEGF mRNA表达[7]

采用半定量PCR法检测坐骨神经NGF mRNA和VEGF mRNA的表达。以软件Primer5.0设计引物并进行扩增。以β-actin为内参基因通过半定量PCR法测定NGF mRNA与VEGF mRNA表达。引物序列：NGF扩增引物：上游5′CAC TCT GAG GTG CAT AGC GT 3′，下游5′GCT TCA GGG ACA GAG TCT CC3′；VEGF扩增引物：上游5′CAT GCG GAT CAA ACC TCA CC3′下游5′TCA CCG CCT TGG CTT GTC AC3′；β-actin扩增引物：上游:：5 ′CAT TGC TGA CAG GAT GCA GAA G 3′ ，下游：5 ′GAG CCA CCA ATC CAC ACA GAG T3′。在PCR扩增体系中，依次加入下列试剂：cDNA 2.0 μL、SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μL、PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μL、ROX Reference Dye ∏(50×) 0.4 μL、灭菌蒸馏水6.8 μL。

PCR扩增程序：变性 94℃ 30 s；退火 65℃ 35 s；延伸 72℃ 70 s，总计循环 30次。最后 1次72℃时延伸 10 min。收集反应过程中荧光，反应结束后，根据开始仪器设定的阈值，计算每份样品中NGF mRNA与VEGF mRNA达到阈值时的Ct值，计算得出相对原始浓度，使用内参基因进行矫正，进而得出每份样品中NGF mRNA与VEGF mRNA相对表达含量。

3 结果

3.1 统计学处理

3.2 黄芪桂枝五物汤对大鼠坐骨神经NGF mRNA表达的影响

结果见表1。实验期间，有部分大鼠死亡，但减少数量在实验允许范畴内。由表一数据得知，模型组大鼠坐骨神经NGF mNRA表达明显低于正常组(P<0.05)；HQG组、MKB组的mRNA表达高于模型组(P<0.05)，但低于正常组(P<0.05)。

表1 各组大鼠NGF mRNA表达的比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与MKB组比较，&P<0.05。

3.3 黄芪桂枝五物汤对大鼠坐骨神经VEGF mRNA表达的影响

由表2数据得知，模型组大鼠坐骨神经VEGF mRNA表达明显高于正常组(P<0.05)；HQG组、MKB组表达低于模型组(P<0.05)，但显著高于正常组(P<0.05)。

表2 各组大鼠VEGF mRNA表达的比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与MKB组比较，&P<0.05。

4 讨论

在神经组织中神经营养因子的合成与表达若是降低，会直接导致神经元和雪旺氏细胞[5]的生理功能减弱，进而诱发DPN各类症状。NGF作为重要的神经营养因子，存在于部分感觉神经元及交感神经元所在的细胞组织内，能够有针对性的保护、修复、再生神经元，抑制神经元凋亡，具有调节神经元发育、分化等生物学效应。研究发现，DPN模型大鼠血液或者组织中NGF mRNA表达量通常降低。本研究中，模型组大鼠坐骨神经中NGF mRNA表达相对量大幅降低，而黄芪桂枝五物汤组与弥可保组较模型组显著升高，提示黄芪桂枝五物汤可通过促使神经因子表达进而保护、修复与再生周围神经。

VEGF既是血管通透性因子，也是诱导血管生长与形成、内皮细胞增值与迁移的多功能因子。具有促进轴突生长；提升神经元、雪旺氏细胞存活率；促进神经内血管与神经再生等作用[8-11]。研究发现，治疗过程中VEGF mRNA表达升高，推测由于高糖环境下VEGF发挥营养因子保护作用而代偿性增加。本研究中，模型组大鼠坐骨神经中VEGF mRNA表达相对量大幅升高，而黄芪桂枝五物汤组与弥可保组较模型组低，提示黄芪桂枝五物汤能抑制神经组织损伤，不需更多代偿性的VEGF mRNA的表达，减轻了DPN损害程度。

综上研究认为，黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变的保护作用可能与加强NGF mRNA表达与减少代偿性VEGF mRNA表达有关。改变大鼠坐骨神经组织中神经营养因子的表达含量，可能是黄芪桂枝五物汤治疗DPN机制之一。

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