富硒姬松茸对小鼠急性酒精性肝炎的保护作用及其机制

刘贵军，李全，于雷

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学附属第四医院，黑龙江 哈尔滨 150001)



富硒姬松茸对小鼠急性酒精性肝炎的保护作用及其机制

刘贵军1，李全1，于雷2*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学附属第四医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：探讨富硒姬松茸对酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法：雌性昆明种小鼠50只，随机分为空白对照组、急性酒精性肝损伤模型组、亚硒酸钠组、姬松茸组和富硒姬松茸组共5个组，每组10只。除空白对照组外，其余各组均用多次灌胃50%酒精的方法建立小鼠急性酒精性肝炎模型。造模同时分别用亚硒酸钠、姬松茸、富硒姬松茸进行干预，空白对照组和模型组每次灌服等量的纯净水。测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量，测定肝组织中白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量与核因子κB(NF-κB)的活性，测定肝总抗氧化能力(T-AOC)。结果：富硒姬松茸能够明显减少饮酒后血清中ALT、AST、COX-2、iNOS、ICAM-1和MDA的含量及肝组织中IL-1β、TNF-α的含量，降低NF-κB的活性，提高肝总抗氧化能力(P<0.05)。结论：富硒姬松茸对小鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用，作用机制可能与抑制TNF-α、IL-1β、ICAM-1、iNOS、COX-2、NF-κB等炎性因子有关。

姬松茸；硒；酒精性肝炎

修回日期：2015-09-10

酒精性肝炎是由于摄入过量酒精导致的肝脏疾病，严重酗酒时可造成肝细胞大量坏死，甚至诱发肝衰竭，严重危害身体健康[1]。目前普遍认为炎症是酒精性肝细胞损伤的罪魁祸首，疾病早期即可出现门静脉周围的炎症细胞浸润及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子的超表达[2]。因此，研发以控制肝脏炎症为目标的治疗药物是治疗酒精性肝炎的有效手段。

硒(Se)是人体的一种微量营养元素，作为谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的辅因子，能促进体内过氧化物的分解，增强机体的抗氧化能力。研究表明，硒可以提高机体抗氧化防御的能力[3-4]。但是，摄入过量的硒会引起中毒，安全摄入硒的最大上限是400 mg/d[5]，由于硒的安全剂量和中毒剂量差别不大，如果要长期使用硒元素，必须解决硒的最佳浓度问题。富硒姬松茸是一种新合成的硒化合物，低剂量的微量元素与食用菌结合，可以有效降低硒毒性，同时保证其生物学功能[6]。

姬松茸属于担子菌类，原产于巴西，在日本和中国民间被广泛用于功能食品领域，常用以预防癌症、肝炎、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、糖尿病和皮炎等疾病，但是，尚缺乏动物实验和临床随机对照研究来验证其治疗效果[7-8]。本实验将富硒姬松茸作用于急性酒精性肝炎模型小鼠，旨在观察其对模型小鼠肝损伤的影响，并初步探讨富硒姬松茸在急性酒精性肝炎中的作用机制，以期为酒精肝的治疗提供具有良好应用前景的药物。

1 材料

1.1 制备亚硒酸钠溶液

将亚硒酸钠溶于0.9%的生理盐水中，每个安瓿瓶中滴入0.4 mL的亚硒酸钠溶液，置于微波炉中杀菌3 min。

1.2 制备姬松茸和富硒姬松茸

姬松茸子实体购自哈尔滨同仁堂。经鉴定无误，实验用其水溶性提取液2 g/ml。将0.4 mg的亚硒酸钠加入上述提取液中制备富硒姬松茸[9]。

1.3 实验动物

雌性昆明系小鼠50只，体质量20～22 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。将小鼠置于室温及正常明-暗周期中，给予标准的实验室食物和充足的淡水。

2 方法

2.1 小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立

将50只9周龄的小鼠随机分组，设为空白对照组、急性酒精性肝损伤模型组、亚硒酸钠组、姬松茸组和富硒姬松茸组共5个组，每组10只。除空白对照组外，连续用50%酒精给小鼠灌胃3次，间隔12 h，单次给予5 g/kg，建立小鼠急性酒精性肝炎模型；空白对照组灌胃等热量的麦芽糖溶液。造模同时将亚硒酸钠、姬松茸、富硒姬松茸分别给小鼠灌胃，每天1次，空白对照组和模型组每天灌服等量的纯净水。小鼠最后一次给药4 h后，经眶静脉丛取血，离心分离血清，20℃冰箱中保存；开胸取肝脏，4℃下冰浴在生理盐水中。

2.2 生化指标的测定

采用ELISA法检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平，试剂盒购自美国西格玛奥德里奇生物公司。

2.3 血清丙二醛含量的测定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)的含量，样本总蛋白质含量用考马斯蓝试剂分析，试剂盒及试剂均购自南京建成生物研究所。

2.4 血清COX-2、iNOS、ICAM-1含量的测定

采用ELISA法检测血清环氧合酶-2(COX-2)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的含量，试剂盒购自恒大百盛生物(北京)科技发展有限公司。

2.5 肝组织中IL-1β、TNF-α含量和NF-κB活性测定

将肝脏样本在5倍容积的Ripa缓冲液中解体，冰上孵育30 min，4℃下20000 g高速离心15 min，重复2次，取上清液待测。采用免疫组织化学法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，试剂盒购自上海劲马生物技术股份公司；采用免疫组织化学法检测核因子κB(NF-κB)的活性，试剂盒购自上海宇博科技有限公司。

2.6 肝总抗氧化能力的测定

按照上述方法制备肝组织的上清液待测。采用ELISA法检测肝总抗氧化能力(T-AOC)，试剂盒购自上海迅达生物技术公司。

3 统计学分析

统计学处理采用SPSS19.0软件，实验数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，均值比较采用邓肯氏新复极差法，P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 富硒姬松茸对模型小鼠血清ALT、AST的影响

如图1所示，与空白对照组相比，模型组ALT、AST水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组ALT、AST水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 富硒姬松茸对急性酒精性肝损伤小鼠外周血ALT、AST水平的影响±s)注：模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4.2 富硒姬松茸对模型小鼠血清MDA含量的影响

如图2所示，与空白对照组相比，模型组MDA含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 富硒姬松茸对急性酒精性肝损伤小鼠外周血MDA含量的影响±s)注：模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图3 富硒姬松茸对急性酒精性肝损伤小鼠COX-2、iNOS、ICAM-1含量的影响±s)注：模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4.3 富硒姬松茸对模型小鼠血清COX-2、iNOS、ICAM-1的影响

如图3所示，与空白对照组相比，模型组COX-2、iNOS、ICAM-1水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组iNOS、ICAM-1水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，富硒姬松茸组COX-2水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)[2]。

4.4 富硒姬松茸对模型小鼠肝组织TNF-α、IL-1β含量和NF-κB活性的影响

如图4a所示，与空白对照组相比，模型组TNF-α、IL-1β含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组TNF-α、IL-1β含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。如图4b所示，与空白对照组相比，模型组NF-κB活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组NF-κB活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 富硒姬松茸对急性酒精性肝损伤小肝组织TNF-α、IL-1β含量及NF-κB活性的影响±s)注：模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图5 富硒姬松茸对急性酒精性肝损伤小肝总抗氧化能力的影响±s)注：模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4.5 富硒姬松茸对模型小鼠肝总抗氧化能力的影响

如图5所示，与空白对照组相比，模型组肝总抗氧化能力显著增强，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，富硒姬松茸组肝总抗氧化能力减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。

5 讨论

5.1 富硒姬松茸对模型小鼠肝功能的影响

酒精进入机体后主要在肝脏代谢，过量摄入会导致肝细胞凋亡和坏死，标志之一就是血浆中细胞内酶的增多[10]。ALT和AST是最重要的细胞内酶之一，能敏感地体现肝实质细胞的损伤程度。因此，密切监测血浆中ALT和AST水平，是评估肝脏功能的重要手段[11-12]。本实验的结果表明，与空白对照组比较，模型组血清ALT和AST水平均明显升高，这与其他文献报道一致，也说明模型小鼠肝功能受损，模型建造较成功。与模型组比较，富硒姬松茸组ALT、AST水平均显著降低，说明富硒姬松茸对小鼠的急性酒精性肝损伤有保护作用。

5.2 富硒姬松茸在模型小鼠急性酒精性肝炎中的作用机制

大量动物实验和临床研究均表明，内毒素和氧化应激是酒精性肝炎的重要致病原因[13]。酒精代谢产物能够损害肠粘膜的通透性，产生大量的肠源性内毒素，激活肝枯否细胞释放TNF-α、IL-1β等炎症因子，直接引起肝窦内皮细胞坏死和凋亡。此外，内毒素、TNF-α还可以激活NF-κB基因途径，介导NF-κB进入细胞核中，启动TNF-α、IFN-γ、IL-1β、iNOS、ICAM-1等炎性因子的转录，从而诱导肝细胞的凋亡和坏死，趋化多形核细胞和淋巴细胞的浸润，加重肝脏损伤[14]。

TNF-α既是NF-κB的激活剂，又是NF-κB的基因产物，这种正反馈效应无疑放大了炎症级联反应，导致肝损伤进一步加重。Khoruts等早在1991年就证实了血清TNF-α含量与酒精性肝损伤的程度正相关[15]。IL-1β是强效致炎因子，可以通过活化T细胞发挥抗炎作用，其水平与机体急性时相反应、ALT/AST等生化指标关系密切[16-17]。iNOS作为诱导酶主要参与一氧化氮(NO)的合成，在生理情况下几乎不表达，但可被内毒素、TNF-α等炎症因子诱导激活，通过NF-κB-iNOS-NO途径生成大量NO，进而诱发强烈的脂质过氧化反应，导致肝组织损伤[18]。COX-2在生理状态下表达于大鼠的脑、肾、脊髓及人的前列腺、肺组织中，在外周血中几乎检测不到，一旦机体受到损伤，在炎症因子的刺激下被大量合成，参与疾病的病理生理过程[19]。酒精及其代谢产物可以刺激COX-2的合成，COX-2主要作为前列腺素-2的关键合成酶参与炎症反应，其水平与肝脏炎症程度密切相关[20]。ICAM-1是一种细胞黏附分子。ICAM-1在NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎症因子的诱导下被激活，与配体淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)结合生成复合物，能够介导T细胞、B细胞、巨噬细胞对肝脏的炎症反应[20]。

氧化应激是指体内氧化和抗氧化状态失衡导致的机体损伤状态。酒精在肝脏代谢的过程中能够产生大量的活性氧(ROS)，从而诱发脂质过氧化反应，激活肝枯否细胞及一系列炎症因子的表达，启动炎症级联反应，引发肝脏损伤[13,21]。MDA是过氧化脂质的重要代谢产物，在氧化损伤的动物模型中，可以较为特异的反应脂质过氧化的程度[22-23]。同时，伴随着机体氧化应激的增强，体内谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化剂减少，抗氧化防御能力也会下降。由于不同的抗氧化剂之间存在相互作用，加之单一测定某种抗氧化剂的抗氧化能力难度较大，实践中通常采用T-AOC对相对总抗氧化能力进行评价，判断肝脏抗氧化的能力[24-25]。

本实验的结果表明，富硒姬松茸组的ALT、AST水平显著低于模型组，说明富硒姬松茸可以有效控制酒精引起的肝脏炎症。富硒姬松茸组的MDA含量显著低于模型组，肝总抗氧化能力亦增强，均提示富硒姬松茸能够减轻机体的脂质过氧化损伤，提高抗氧化防御能力，这可能是其发挥抗炎作用的机制之一。此外，富硒姬松茸还能抑制炎症因子ICAM-1、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β的表达，这可能与富硒姬松茸阻断NF-κB相关的基因途径有关，由此推断，富硒姬松茸可以通过调节体内炎症因子的失衡发挥抗炎作用。但是，与模型组比较，亚硒酸钠组和姬松茸组的上述指标均无明显变化，说明亚硒酸钠和姬松茸的抗炎作用较弱，只有姬松茸和亚硒酸钠相结合才可以对小鼠的酒精性肝损伤起到保护作用。

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Protective Effect of Selenium-enriched Agaricus Blazei Murill onAcute Alcoholic Hepatitis in Mice and Its Mechanism

LIU Gui-jun1，LI Quan1，YU Lei2*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFourthHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective: To study the protective effect of Selenium-enriched Agaricus blazei Murill (Se-AbM) on alcohol-induced liver injured mice and its mechanism, in order to provide an aussichtsreich drug for alcoholic hepatitis. Methods: Fifty female Kunming mice were allocated randomly into five groups: blank control, moldel of acute alcoholic hepatitis, sodium selenite (SS), agaricus blazei murill (ABM), and Se-AbM, with 10 mice in each group. The blank control group received no treatment and others were fed intragastrically with 50% ethanol repeatedly for making rat models with acute alcohol liver hepatitis. SS, AbM, and Se-AbM were gavaged simultaneously with ethanol treatment, when the blank control and the model group received a comparable amount of water solution every time. Subsequent serum alanine aminotransferase (ALT) level, aspartate aminotransaminase (AST) level, maleic dialdehyde (MDA) level, inducible nitric oxide synthase (iNOS) level, intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) level, cyclooxygenase-2 (COX-2) level, hepatic tumor necrosis factor-α (TNF-α) level, interleukin-1β (IL-1β), nuclear factor kappa B (NF-κB) level, and hepatic total antioxidant status (TAOS) were determined. Results: Se-AbM administration markedly decreased serum ALT, AST, ICAM-1, COX-2, iNOS and MDA levels, hepatic IL-1β, TNF-α and NF-κB levels, and improved the liver total antioxidant capacity compared with alcohol administration(P<0.05). Conclusion: Se-AbM has a significantly protective effect on ethanol-induced liver injured mice,and the mechanism is related to the inhibition of inflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-1β,ICAM-1, iNOS, COX-2, NF-κB etc.

Agaricus blazei Murill;Selenium;Alcoholic hepatitis

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0015-05

刘贵军(1979-)，男，助理研究员，医学博士，主要研究方向：方剂配伍规律研究。

于雷*(1977-)，男，研究员，医学博士，硕士研究生导师，主要研究方向：传染病的诊断与治疗。

2015-08-25