Exendin-4对高糖培养肾小球系膜细胞ECM分泌的影响及相关机制

林晓璐 张红 夏小慧 陈娟 张日东 章向成 李伟

·论著·

Exendin-4对高糖培养肾小球系膜细胞ECM分泌的影响及相关机制

林晓璐 张红 夏小慧 陈娟 张日东 章向成 李伟

目的研究exendin-4对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)细胞外基质分泌的影响及相关机制。方法体外培养GMCs，分为4组：正常对照组(NC组)、正常对照+exendin-4组(NCE组)、高糖组(HG组)、高糖+exendin-4组(HGE组)；HGE组细胞分别给予3，5，10，15，30 nmol/L exendin-4培养12，24，48 h，采用细胞增殖与活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK8)法测定细胞增殖情况，确定exendin-4的最适作用时间与浓度。ELISA测定细胞上清中细胞外基质蛋白纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原蛋白水平。RT-PCR检测FN、Ⅳ型胶原蛋白及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA的表达。Western印迹测定核因子-κB的表达。结果(1)高糖培养的GMCs给予10 noml/L exendin-4培养24 h后，其细胞增殖率较3 nmol/L、5 nmol/L的exendin-4明显降低(F=120.808,Plt;0.05)；与15 nmol/L、30 nmol/L相比，10 noml/L(HGE组)的exendin-4对GMCs增殖率无明显变化(P均gt;0.05)。(2)与NC组、NCE组相比，HG组FN、Ⅳ型胶原蛋白分泌及mRNA以及MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表达均显著升高(F=6.894～166.914,P均lt;0.05)；与HG组相比，HGE组FN、Ⅳ型胶原蛋白分泌及mRNA以及TNF-α、MCP-1、ICAM-1、TGF-β1mRNA表达量明显降低(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)。(3)与NC组、NCE相比，HG组核因子-κB蛋白的表达明显增多(F=133.1，Plt;0.05)。与HG组相比，HGE组核因子-κB蛋白的表达则明显受到抑制(F=133.1,Plt;0.05)。结论Exendin-4抑制高糖培养GMCs的细胞外基质分泌，与其抑制核因子-κB介导的炎性反应有关。

Exendin-4；肾小球系膜细胞；炎症；核因子-κB

糖尿病肾病(DN)是糖尿病慢性微血管并发症之一，其基本病理改变为系膜细胞增生、基底膜增厚、细胞外基质(ECM)积聚及肾小球硬化、肾脏纤维化，最终导致肾功能衰竭。代谢紊乱和血流动力学异常作为启动子，激活了肾组织内多种炎性分子及炎性信号通路，这些因素共同导致了肾脏的结构和功能的异常[1]。更好地了解DN中的炎性反应，将有助于找到新的治疗人类糖尿病肾脏疾病的新策略。

胰高血糖素样肽(GLP)-1与GLP-1受体(GLP-1R)结合后，通过促进胰岛β细胞分泌胰岛素、抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素、抑制食欲、延缓胃排空等途径降低血糖[2]。Exendin-4与人GLP-1有53%的同源性，与GLP-1R高度亲和，其特殊的分子结构使还其能有效抵抗二肽基肽酶Ⅳ的降解[3-4]。国内、外研究发现，exendin-4干预治疗可改善糖尿病大鼠尿白蛋白排泄、肾小球肥大、系膜基质扩张，不仅能抑制ECM成分的合成，还能增强ECM成分的降解[5-6]。目前，exendin-4发挥肾脏保护作用的具体机制尚未研究透彻。本研究旨在通过建立体外模型，观察exendin-4对高糖环境下的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)ECM分泌及炎性反应信号的影响，初步探讨其中的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 低糖及高糖DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司，exendin-4购自Ana Spec公司，细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)购自上海七海复泰生物科技有限公司，ELISA试剂盒购自美国RB SCIENTIFIC公司，Trizol总RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自上海碧云天生物技术研究所， 兔抗核因子-κB p65单克隆抗体购自德国CST公司，磷酸酶标记山羊抗兔IgG购自上海优宁维生物科技有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 选取大鼠GMCs HBZY-1(细胞株名称，徐州医学院药理学实验室)，在无菌条件下0.25%胰酶消化2 min，观察细胞分散成拉网状，终止消化。加入DMEM培养液反复轻柔吹打，并均匀接种，置37℃、5%CO2温箱中孵育，传代，3～6代细胞用于实验。当细胞接近亚融合状态时改用无血清培养液培养24 h以同步化，随后以GMCs为实验对象。采用含10%胎牛血清的完全培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱内。

1.2.2 实验分组 (1) 正常对照组(NC组)：采用含糖5.6 mmol/L的DMEM培养基培养。(2)正常对照+exendin-4组(NCE组)：采用exendin-4(10 nmol/L)预处理24 h，弃去培养基，然后加入低糖(5.6 mmol/L)培养基和exendin-4(10 nmol/L)共孵育。(3)高糖组(HG组)：采用含糖30 mmol/L的DMEM培养基培养。(4)高糖+exendin-4组(HGE组)：分别采用exendin-4(3，5，10，15，30 nmol/L)预处理24 h，弃去培养基，然后加入高糖(30 mmol/L)培养基和exendin-4(3，5，10，15，30 nmol/L)共孵育，记为HGE3组、HGE5组、HGE组、HGE15组、HGE30组。细胞同步化24 h后分别按上述要求处理细胞用于实验。

1.2.3 CCK-8法测定GMCs的增殖情况以确定exendin-4的最适作用时间与浓度 取对数生长期的GMCs，按每孔3 000个细胞悬液100 μl接种在96孔培养板上，待细胞贴壁后，换用无血清的培养基饥饿24 h，使细胞同步于G0期后，HGE组细胞分别予3，5，10，15，30 nmol/L exendin-4培养，每组设5个复孔，另外设空白对照孔(只有培养液，无细胞)。分别将培养板放入37℃、5%CO2恒温培养箱中培养12，24，48 h后，选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，记录结果，所得exendin-4最适作用时间与浓度结果在以下的实验数据中均用HGE组表示。

1.2.4 ELISA测定细胞上清中ECM纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原蛋白水平 收集24 h处理组细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，相同标本设3个复孔，重复3次，在酶标仪450 nm测定吸光度值，根据标准曲线及吸光度值计算各样本的相应浓度。

1.2.5 RT-PCR检测FN、Ⅳ型胶原蛋白、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1) mRNA表达 按照Trizol法提取组织总RNA，采用紫外分光光度法测定RNA在260 nm和280 nm的吸光度，计算RNA含量，逆转录合成cDNA。PCR引物序列见表1，反应体系为25 μl，反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min 30个循环。取各样本目的基因PCR产物6 μl、β-actin产物2 μl，用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，110 V电泳50 min，EB染色。凝胶成像分析系统采集电泳图像，用Image J软件计算目的基因相对于内参β-actin的灰度值。

1.2.6 Western印迹检测核因子-κB蛋白的表达 取GMCs消化后，用PBS清洗3遍后，加入裂解液，裂解30 min后移入1.5 ml EP管中，于4℃下12 000 r/min(r=9.5 cm)，离心10 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-80℃保存。采用BCA法测定总蛋白浓度，取15 μl(7.5 μg)蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，BSA封闭2 h，4℃置于一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST摇动漂洗10 min×3次，加入二抗(1∶1 000)并于室温下孵育2 h，TBST洗膜3次各10 min，显色，扫描仪记录实验结果。应用Image J软件分析目的蛋白及内参蛋白灰度值，计算相对灰度值。

表1 目的基因及内参基因引物序列

注：FN：纤维连接蛋白；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；TGF-β1：转化生长因子-β1；β-actin：β-肌动蛋白

2 结果

2.1 Exendin-4最适作用时间与浓度 高糖培养的GMCs给予10 noml/L的exendin-4培养，其HGE组细胞增殖率较HGE3组、HGE5组明显降低(Plt;0.05)；与HGE15组、HGE30组相比，10 noml/L的exendin-4 HGE组对GMCs增殖率无明显变化(Pgt;0.05)。同时高糖培养下GMCs给予10 nmol/L的exendin-4处理24 h，其细胞增殖率较12 h、48 h均明显降低(Plt;0.05)，见表2。

2.2 Exendin-4对GMCs细胞上清FN和Ⅳ型胶原蛋白的影响 与NG组、NGE组相比，HG组FN、Ⅳ型胶原蛋白的表达升高(F=72.139、140.519，P均lt;0.05)；与HG组相比，HGE组的FN及Ⅳ型胶原蛋白表达降低(F=72.139、140.519，P均lt;0.05)，见图1。

2.3 Exendin-4对GMCs FN、Ⅳ型胶原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表达的影响 与NG组、NGE组相比，HG组FN、Ⅳ型胶原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA的表达升高(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)；与HG组相比，HGE组FN、Ⅳ型胶原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1mRNA表达降低(F=6.894～166.914，P均lt;0.05)，见图2。

2.4 Exendin-4对GMCs核因子-κB表达的影响 与NG组、NGE组相比，HG组GMCs中核因子-κB的表达量明显增多(F=133.1，Plt;0.05)；与HG组相比，HGE组核因子-κB的表达量降低(F=133.1，Plt;0.05)，见图3。

表2 Exendin-4对GMCs增殖的影响

注：与NG组相比，aPlt;0.05；与HG组相比，bPlt;0.05；NG组：低糖组；HG组：高糖组；HGE3、HGE5、HGE、HGE15、HGE30组：高糖加3、5、10、15、30 nmol/L exendin-4组；GMCs：肾小球系膜细胞

注：与NG组、NGE组相比， aPlt;0.05；与HG组相比，bPlt;0.05；NG组：低糖组；NGE组：低糖加exendin-4(10 nmol/L)组；HG组：高糖组；HGE组：高糖加exendin-4(10 nmol/L)组；FN：纤维连接蛋白；COL-Ⅳ：Ⅳ型胶原蛋白图1 Exendin-4对高糖条件下系膜细胞FN、Ⅳ型胶原蛋白的影响

3 讨论

DN是糖尿病最常见的微血管并发症，早期出现肾小球内高压以及肾小球滤过率增加，肾小球ECM合成增加及基底膜增厚，导致肾小球系膜区扩张，逐渐发展成为肾脏的纤维化和硬化，最终导致肾功能衰竭。DN的发病机制复杂，迄今尚未完全清楚。由高血糖介导的代谢异常和血流动力学改变是导致DN的主要原因。最近越来越多的研究发现，氧化应激、蛋白质非酶糖基化、蛋白激酶C途径以及肾素-血管紧张素系统激活、炎性反应(如炎性细胞、炎性细胞因子激活)等途径也与DN的发生、发展有关[7]。这些途径均可以引起核因子-κB活性增强，活化后的核因子-κB进一步启动许多与DN相关基因的转录。因此，核因子-κB在DN发生、发展中起重要作用[8]。

ECM是肾小球系膜区围绕系膜细胞的非弥散的固相介质，能够调节系膜细胞增生和分泌各种活性物质，其中FN和Ⅳ型胶原蛋白是构成ECM的重要成分。本实验选取大鼠GMCs，并对细胞上清中FN和Ⅳ型胶原蛋白的分泌及表达进行测定，证实高糖可使FN和Ⅳ型胶原蛋白的含量明显升高，这与Nahman等[9]的研究结果一致。

核因子-κB在GMCs、毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和经血液循环进入肾脏的免疫细胞中都存在，其作为一个重要的转录因子，可以被许多细胞外刺激激活，活化后的核因子-κB进入细胞核内，与多种炎性因子启动子区域中κB序列结合，参与细胞凋亡、炎性反应等多种条件下的基因调控[10]。近年来研究亦表明，核因子-κB在GMCs活化、增生和炎性介质产生中处于中心地位[11]。

有研究表明，核因子-κB可诱导多种细胞因子(如白细胞介素-2、白细胞介素-6)、黏附因子[ICAM-1、血管细胞黏附分子(VCAM)-1、趋化因子(MCP-1、C3)]等编码基因的表达[12]。本研究发现，在高糖诱导的GMCs中炎性相关因子MCP-1、ICAM-1表达明显升高，给予exendin-4干预后MCP-1、ICAM-1 mRNA的表达受到抑制。而已有研究表明，在DN动物模型中，MCP-1、ICAM-1表达明显增加，敲除MCP-1基因的1型糖尿病和2型糖尿病大鼠，其肾损伤明显减轻[13]。而敲除ICAM-1基因小鼠DN的发生延迟[14]。因此，exendin-4可以通过减少黏附因子与趋化因子的表达来对GMCs进行保护，且这种机制与抑制核因子-κB通路有关。

注：与NG组、NGE组相比,aPlt;0.05；与HG组相比,bPlt;0.05；NG组：低糖组；NGE组：低糖加exendin-4(10 nmol/L)组；HG组：高糖组；HGE组：高糖加exendin-4(10 nmol/L)组；FN：纤维连接蛋白；COL-Ⅳ：Ⅳ型胶原蛋白；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；TGF-β1：转化生长因子-β1图2 Exendin-4对高糖条件下系膜细胞FN、Ⅳ型胶原蛋白、MCP-1、TNF-α、ICAM-1、TGF-β1 mRNA的影响

注：与NG组相比，aPlt;0.05；与HG组相比，bPlt;0.05；NG：低糖组；NGE组：低糖加exendin-4(10 nmol/L)组；HG：高糖组；HGE组：高糖加exendin-4(10 nmol/L)组；NF-κB：核因子-κB图3 Exendin-4对高糖培养肾小球系膜细胞核因子-κB蛋白表达的影响

TNF-α在肾组织中主要由GMCs、肾小球细胞和内皮细胞、肾间质树突状细胞等产生，在实验性糖尿病大鼠肾脏中TNF-α的表达明显增多[15]。TNF-α作为一种高效的促炎细胞因子，可以直接刺激系膜细胞产生多种炎性介质如MCP-1和ICAM-1[16]。其还可通过膜受体逐级激活，最后使游离的核因子-κB激活，这两种因子相互作用，进一步加重肾脏损害。本研究发现大鼠GMCs在高糖的影响下TNF-α mRNA表达较NC组明显升高，而给予exendin-4干预后，其表达受抑制，同时与核因子-κB的表达有关。

TGF-β1是一种多功能、能多向调节的中心细胞因子，它不仅可以直接促使肾脏肥大，还可以通过诱导ECM沉积而具有强烈促纤维化作用使肾小球硬化，并且能诱导炎性细胞浸润和成纤维细胞增生。大量研究已经证实，TGF-β1与DN的发生、发展关系密切[17-18]。Mirza等[19]研究发现，TGF-β1的活化剂转谷酰氨酶的前体由核因子-κB调控，进一步研究表明，缺乏TGF-β1的大鼠会表现出异常的核因子-κB激活(主要是通过Toll样受体4)，最后会因严重炎性反应综合征而死亡[20]。由此推测，肾组织中核因子-κB的活化，可促使TGF-β1表达增加，导致ECM合成增加，在DN的发病过程中具有重要作用。

作为GLP-1的类似物，exendin-4不仅具有降血糖的作用，而且对于DN也有一定的保护作用[21]。目前应用于临床的exendin-4类药物为人工合成多肽产物艾塞那肽(exenatide)，其与exendin-4有50%的结构同源性。本研究发现，和ECM的分泌、炎性相关介质变化类似，高糖作用下核因子-κB的活性升高，经exendin-4干预后活性则明显被抑制，说明exendin-4抑制高糖培养下大鼠GMCs ECM的分泌，与其抑制核因子-κB介导的炎性反应有关，其可有效阻止DN的进一步发展。这一研究结果为exendin-4对DN的保护作用提供了强有力的理论依据，但其具体的分子机制尚不明确，需深入研究。

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Effectsandmechanismofexendin-4onextracellularmatrixsecretionofmesangialcellsculturedinhighglucose

LinXiaolu*,ZhangHong,XiaXiaohui,ChenJuan,ZhangRidong,ZhangXiangcheng,LiWei.

*GraduatedSchoolofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China

Correspondingauthor:LiWei,Email:Liwei.190@hotmail.com

ObjectiveTo explore the effects and mechanism of exendin-4 on the secretion of extracellular matrix in high glucose-cultured glomerular mesangial cells (GMCs).MethodsGMCs were culturedinvitroand divided into 4 groups: normal control (NC) group, normal control with exendin-4 (NCE) group, high glucose (HG) group, high glucose with exendin-4 (HGE) group. Cells in HGE group were treated with 3, 5, 10, 15 or 30 nmol/L exendin-4 for about 12, 24 or 48 hours, respectively. The proliferation and cell activity of GMCs were used to assess the most suitable culture time and concentration using Cell Counting Kit-8. The levels of fibronectin (FN) and collagen type Ⅳ in the cell supernatant were measured by ELISA. The levels of collagen type Ⅳ, FN, monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), tumor necrosis factor (TNF)-α, intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1), transforming growth factor-β1(TGF-β1) were evaluated by RT-PCR. The expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in each group was analyzed by Western blotting.Results(1) After treated by 10 nmol/L exendin-4 for 24 hours, the growth rate of GMCs cultured in high glucose was significantly decreased compared with 3 nmol/L or 5 nmol/L (F=120.808,Plt;0.05), but not different from 15 nmol/L or 20 nmol/L (allPgt;0.05). (2)Compared with NC group and NCE group，the expression of FN, collagen type Ⅳ, as well as their mRNA level and the inflammatory mediators such as MCP-1, TNF-α, ICAM-1 and TGF-β1were significantly increased in HG group(F=6.894-166.914, allPlt;0.05). Compared with HG group, the protein and mRNA level of FN and collagen type Ⅳ, and the expression of TNF-α, MCP-1, ICAM-1 and TGF-β1were inhibited greatly in HGE group (F=6.894-166.914, allPlt;0.05).(3)Compared with NC group and NCE group, the expression of NF-κB increased significantly in HG group (F=133.1,Plt;0.05). Compared with HG group, the expression of NF-κB was suppressed significantly in HGE group (F=133.1,Plt;0.05).ConclusionExendin-4 inhibits the secretion of extracellular matrix of GMCs cultured in high glucose, and the mechanism is associated with the inhibition of inflammation induced by NF-κB.

Exendin-4; Glomerular mesangial cells; Inflammation; Nuclear factor-κB

国家自然科学基金资助项目(81200595，81400807)；江苏省卫计委科研项目(H201253)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.05.05

221000 徐州医学院研究生院(林晓璐，夏小慧)；223001 南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科(陈娟，张日东，章向成，张红)；221000 徐州医学院附属医院内分泌科(李伟)

李伟，Email:Liwei.190@hotmail.com

FundprogramNational Natural Science Foundation of China(81200595，81400807)；Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning(H201253)

2015-10-28)